同定および分析
ヒアルロン酸分布
主要骨格である
Joe G. Hollyfield: Joe G. Hollyfield博士は、1966年、テキサス大学にて動物学博士号を取得した。その後、Fight for Slight, Inc. (Schaumburg, IL)の奨学金により、オランダ、UtrechtのHubrecht LaboratoryのPostdoctoral Fellowshipとしてトレーニングを積んだ。1969年、ニューヨーク市のColumbia University, College of Physicians and SurgeonsのDepartment of Anatomy assigned to OphthalmologyのAssistant Professorに任命される。1977年、Baylor College of MedicineのCullen Eye Instituteに移りThe Foundation Fighting Blindness (Hunt Valley, MD)の支援をうけ、Director of Research Centerとなる。1995年、Hollyfield博士はThe Cleveland Clinic Foundationに加わり新しく設立されたCole Eye InstituteのDirector of Reseatchとなる。彼の研究は、網膜と網膜色素上皮の発生および細胞生物学への貢献が認められ、International Society for Eye Research (San Francisco, CA)のThe Endre Balazs Prize、The Alcon Research Institute Award (Ft. Worth, TX)、Retina Research Foundation (Houston, TX)のthe Marjorie W. Margolin and the Sam and Bertha Brochstein Awards、 Research to Prevent Blindness (New York, NY)からの賞、Allergan Laboratories (Irvine, CA)のthe Ocular Cell and Molecular Bioligy Prize、Hendrix College (Conway, AR)のthe Distinguished Alumnus Awardなどの数々の栄誉を受けている。現在、Hollyfield博士はInternational Society of Eye Researchの事務局長と会頭、 the Association for Research in Vision and Ophthalmology (Bethesda, MD)の理事会のメンバーおよび会頭として活躍されている。1992年よりExperimental Eye Researchの編集長である。 |
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光に反応して最初の神経シグナルを産生する光受容体細胞は脊椎動物の網膜の外層に位置する。これらの一次感覚神経は、別々の領域に区画化された特異的な光受容体機能をコントロールする細胞小器官と共に細長く伸びている。視色素を含み、光感受性である外節は細胞の最も遠位にある。外節は、粗面小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリアなどが存在している内節と、毛様部により連結される。内節の下には核があり、これは網膜の外核層に位置する。軸索は短く、神経終末は外網状層に接する。IPMは網膜色素上皮と外境界膜の間の区画を満たす。このマトリックスは、網膜の外表面から突出している内外節の光受容体を取り囲んでいる。光受容体-網膜色素上皮間の代謝産物の輸送や交換はIPMを介して行われている。（顕微鏡写真は正常のヒト成人網膜を示す。）
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IPMが位置する組織境界面は、眼胞が消失し眼杯の二重壁が形成される初期眼発達において出現する。この初期形態形成において、眼杯壁の神経上皮の内層（後の網膜）、外層（後の網膜色素上皮、RPE）それぞれの頂側面をひきあわせる。この図は、受精後45日のヒト胎児の外眼壁の光受容体細胞（＊）形成前と同じ領域の48歳の成人の眼の網膜外表面から細長く伸びた光受容体細胞(＊）を比較したものである。基底膜下にある結合組織マトリックスとは対照的に、IPMは上皮由来の二層間に存在し、これは上皮細胞頂側表面にある糖衣に相当する。
初期のIPMの生化学研究では、細胞外分子を網膜の外側から洗い出して解析しようと試みられていた。この方法では少量のヒアルロン酸（以下HAと略記する）とコンドロイチン硫酸が同定された。1-8 このマトリックス中に新しいレクチン分子の存在が知られ、より積極的なIPMの抽出法が用いられるまで、HAとその関連分子が水性溶液で抽出されにくいことが知られなかった。9,10 ウシ11とヒト12の網膜を使った研究では最初にIPMの水親和性が確認された。網膜を蒸留水中に置くと細胞外部分が急速に腫脹して、網膜外側からはがれ、これで迅速にIPMが分離される。 (Figure 3)。
網膜やその断片を蒸留水中に置くと、IPMの高い水親和性により平常時の2.5倍以上に膨張する。この組み合わせ図は3 mm径の円板状の網膜を蒸留水中に置いたときのIPMの剥離を示したものである。大きく膨張した透明なシート（右）にIPMが含まれている。この物質はチョーク様の網膜内層から容易に分離でき、形態的、生化学的解析に利用できる。
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画像 (a) は中心窩（黄中心）を含む3 mm径の円板状のヒト成人網膜で、蒸留水処理により部分的にIPMが脱離している。剥離したIPMをFITCラベルしたPNAで染色すると、中心窩の錐体周囲のマトリックス中に、緑色の蛍光が連続して細網状に観察される (b) 。錐体の密度が低くなる中心窩の周辺では、やはり錐体関連マトリックスとPNAは結合するが、染色されるそれぞれの錐体のマトリックスは、中心窩にある個々の錐体周囲のマトリックスと比較して増大している (c, d) 。PNAに修飾された錐体のマトリックスの側面像である (c) 。これらの明るい蛍光の部位は [Fig. 1] で示した内節および外節の錐体周囲に見える透明な領域を占めているのであろう。正面像で見ると、所々見られる杆体マトリックス区画を除き、錐体マトリックス区画の同部位がPNAで染まる(d)。Rhodamineラベルしたwheat germ agglutinin (WGA) では錐体マトリックス区画は弱く染色されるだけだが、杆体マトリックスは強く染色される (e) 。FITCラベルPNAとrhodamineラベルWGAを同時に使うと、錐体マトリックス区画が黄色に染まり、錐体周囲に両方のレクチンが共存していることが明瞭となる (f) 。分離されたIPMの電顕像は、蒸留水で分離したIPMが細胞成分ではなく光受容体周囲のマトリックス成分であることを実際に証明している (g) 。この画像中では、IPMは杆体光受容体に占められていた電子透過性のスペース（この空間領域にはいくつかの膜の破片が見える）周囲の相互に連結された細線維様の突起の細網状構造形成からなる。分離IPMを一塊のままWGA-ferritinで染色すると、ferritinがマトリックス細線維状構造に結合していることが認められる。
様々な種の哺乳類のIPMは[Fig. 3]で示した方法で同様に分離できる。これまでに調べた全ての動物で [Fig. 4] で述べたヒトIPMと同様のレクチン染色パターンをとる。
同定および特性
分離されたIPM中の杆体および錐体関連領域のレクチン結合特性は、この区画に含まれる特異的分子の同定および特徴づけに役立った。マトリックス分子をSDS/PAGEとブロッティングで分析すると、PNAで染まる150kDの大きさの1本のバンドが認められた (Figure 6) 。
IPMタンパクとプロテオグリカンのレクチン染色およびウエスタンブロットはSDS/PAGEで分離して行った。対になっているサンプルレーンはそれぞれレクチンまたは抗体のブロットを表している。レーン1は未消化IPMサンプル、レーン2はコンドロイチナーゼABC消化したIPMサンプルを含む。上段：未消化サンプルではPNAは150kDのシングルバンドのみに結合する。酵素消化により、230kDの顕著なバンドを含むいくつかの高分子量のバンドが現れる。WGAブロットではより多くのバンドが現れるが、150kDのバンドは消化前後で共に顕著であり、それに対して230kDのバンドはコンドロイチナーゼ消化後に最も明瞭となる。コンドロイチナーゼABC消化後に残った2糖のコンドロイチン6硫酸を認識するΔDi6Sモノクローナル抗体は未消化サンプルとは反応しないが、コンドロイチナーゼ消化サンプルでは230kDのバンドを強くラベルする。レーン下方には、いくつかバックグラウンドが染色されるものの150kDのバンドはラベルされない。下段：左に示したものに相当するCoomassie Blue染色したポリアクリルアミドゲルから150kDのバンド (SPACR) と230kDのバンド (SPACRCAN) を切り出した。これらの分離したバンドはポリクローナル抗体作製に使用した。ウエスタンブロットに抗SPACR抗体を用いると150kDに免疫反応性のシングルバンドが現れ、染色強度はコンドロイチナーゼABC消化の前後で同様である。対照的に、抗SPACRCAN抗体ではコンドロイチナーゼABC消化後のみに免疫反応が現れ、反応は主に230kDのSPACRCANのバンドに対してである。
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[Fig. 6] で述べたSPACRとSPACRCANの抗体の免疫反応の局在を調べるため、霊長類（アカゲザル）の網膜の切片を用いた。それぞれの抗体によるIPM区画の強い免疫反応と、免疫前血清コントロールによるIPM染色の欠如に注目してもらいたい。
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予想されるアミノ酸配列中の主要モチーフを表したヒトSPACRおよびSPACRCANの分子モデル。
別記（19）で詳細を述べたようにSPACRとSPACRCANは構造的に高い相同性を示す。両分子とも、多数のO結合型オリゴ糖鎖の結合可能部位を含むポリペプチド中央の領域に、大きなムチン様ドメイン（黄色の領域）を持つ。N結合型オリゴ糖鎖のコンセンサス部位（青いＹ字型の突出）の集団がムチン様ドメインの両側に存在する。上皮細胞成長因子 (EGF) 様ドメイン（緑の円）は、SPACRでは1つ、SPACRCANでは2つ、C末端付近に存在する。両分子はムチンドメインのN末端側に推定上のRHAMMタイプHA結合モチーフ（青い四角）を含む。SPACRCANはC末端近くに第２のHA結合モチーフを持つ。SPACRCANは4カ所のグリコサミノグリカン鎖が結合するコンセンサス部位を含む（これらの部位に結合した鎖は鋸歯状の青線で表した）。哺乳類ではグリコサミノグリカン鎖が結合する通常のコンセンサス部位はSPACRには存在しないが、トリではムチンドメインのN末端側にグリコサミノグリカン鎖結合部位が存在する。コンドロイチン硫酸とNおよびO結合型糖複合体の酵素的除去によるSDS/PAGEでの移動度の変化は、糖は見かけ分子量が400kDであるSPACRCAN分子の3分の2を占めることを示している。同様の実験より糖タンパクSPACRでは、NおよびO結合型糖鎖が見かけ上の分子量の約3分の1を占めることを示している。
a このシリーズのTurleyとHarrisonの総説を参照。
ヒアルロン酸分布
IPM中のHAの分布を検索するために、HAを保持した状態でヒト網膜の切片を検鏡できるように、特異的プローブとしてアグリカン由来のビオチン化HA結合複合体 (bHABC) を用いた (Figure 9) 。硝子体側の網膜表面と脈絡膜の結合組織は強く染色され、IPMは全体に弱い染色が認められた。Streptomyces hyaluronidaseはHAに対して高い特異性を持つため、組織切片上のbHABCの局在の特異性を検証するために多くの研究者がこの酵素を用いた消化を行っている。驚いたことにIPM中のHA染色はStreptomyces hyaluronidase消化に対して抵抗性であった。そのために、約22糖鎖長のHAオリゴとbHABCのプレインキュベーションにより染色をブロックするコントロール実験の必要があった。これらの吸収コントロールはIPMの染色を完全に抑え、プローブは実際にIPM中のHAと相互作用していることを示した (Figure 9) 。
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切片は54歳男性ドナーの眼から作成した。 (a) この切片はHA分布を実証するためにbHABCで染色した。脈絡膜および水晶体と接する網膜表面が強く染色される。IPMは中等度に染色される。 (b) この切片はbHABC染色の前にStreptomyces hyaluronidase消化を行った。この酵素処理では脈絡膜と水晶体側の網膜表面の染色は消滅したが、IPM中のHA染色レベルは未消化サンプルより増強されている。 (c) 未消化およびStreptomyces hyaluronidase消化した切片に、あらかじめ22糖鎖長のHA断片とインキュベートしたbHABCプローブを用いると染色は全て消滅し、網膜色素上皮内の黒いメラニン色素のみが残る（ [Fig. 10] 参照）。
IPM中のHAのStreptomyces hyaluronidase消化に対するこの奇妙な抵抗性を探究するために、他のHAを分解する酵素であるStreptococcus hyaluronidase、精巣ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼABCを同様の実験に用いた。これらの酵素はHAと同様にコンドロイチン硫酸も分解し、それぞれIPMの染色も完全に消滅させた。結果は、これらのコンドロイチン硫酸とHA両方を分解しうる酵素はIPM中のHAを分解するが、HAのみを分解しうる酵素はIPM中のHAを分解できないことを示している (Figure 10) 。
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bHABCとインキュベートしたコントロールは、IPM中のHAの弱い染色と脈絡膜中のHAのより強い染色を示している (a) 。Streptomyces hyaluronidase（HAに対し特異性高い）消化後、脈絡膜中のHA染色は消失するが、IPM中のHA染色レベルは未消化コントロールより増強されている (b)。22-糖鎖長のHA断片とインキュベートしたbHABCを用いるとStreptomyces hyaluronidase 消化後に存在したHA染色はすべて消失する(c)。組織をStreptococcus hyaluronidase（HAおよびコンドロイチン硫酸を分解する）で消化するとIPMと脈絡膜中の染色は消失する (d) 。組織を精巣ヒアルロニダーゼ（HAおよびコンドロイチン硫酸を分解する）で消化するとIPMと脈絡膜中の染色は消失する (e) 。組織をコンドロイチナーゼABC（コンドロイチン硫酸とHAを分解する）で消化するとIPM中の染色は消失するが、脈絡膜中の染色は残存する (f) 。これらの消化は、コンドロイチン硫酸とHAの両者を分解する酵素はIPM中のHAを分解できるが、HAのみを分解する酵素はIPM中のHAを分解できないことを示している。これらの結果より、我々はIPM中のプロテオグリカンSPACRCANに共有結合するコンドロイチン硫酸がStreptomyces hyaluronidaseのHA骨格への接近を妨げると考える。コンドロイチン硫酸が分解されると、複合体中に深く埋もれているHAは分解されやすくなる。
以上の結果より、コンドロイチン硫酸が共有結合しているプロテオグリカンSPACRCANがStreptomyces hyaluronidaseのIPM中のHA骨格への接近を阻止すると考える。正常ではコンドロイチン硫酸に遮蔽されているHAは、コンドロイチン硫酸が分解されると分解に対して脆弱となる。これらの結果より示唆されるSPACR、SPACRCAN、HAの関連を表したIPMのモデルをFigure 11に示す。
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SPACRおよびSPACRCANとIPM中のHA骨格の結合モデルは [Fig. 10] に示したHAの酵素分解のデータに基づく。SPACRCANに結合するコンドロイチン硫酸鎖は、HA骨格をHA特異的な分解酵素から保護する。コンドロイチン硫酸とHAを攻撃する酵素がHA骨格を分解できるのは、コンドロイチン硫酸鎖の分解により、深部にあるHA骨格が酵素に曝されるためである.
マトリックスの主要骨格である
新しい糖タンパクSPACRとプロテオグリカンSPACRCANの解析や、それらの実証された相互作用から、我々はHAがIPM中のこれらを含む分子をアンカーする基本的な骨格として機能するのではないかと考えた。他のHAに結合する分子は、IPMと接する細胞（ミューラー細胞、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞）の細胞膜にある。これらの中には、広く知られているHA結合蛋白であり、ミューラー細胞の微絨毛の尖端に存在するCD 446や、網膜色素上皮（RPE）の頂側領域に局在するRHAMM22が含まれる。光受容体の細胞膜に存在するプロテオグリカンであるニューログリカンCは、細胞外ドメインにRHAMMタイプのHA結合モチーフを含む。23 Oxygen-regulated photoreceptor protein-1 (ORP-1) をコードする遺伝子の発現が光受容体内に認められ、これが網膜色素変性症の遺伝子座に関連することが最近になって発見された。24 ORP-1の予想されるアミノ酸配列はHA結合モチーフと推測される部位を14カ所含む。つまりはIPMと接している細胞表面のHA結合モチーフの存在が、細胞とHA骨格との相互作用を可能にする構造的な構成成分となっている。IPMの両側の細胞とHA骨格との結合が、このようなタンパク−糖や糖−糖の相互作用を介してIPMによる網膜とRPE間の構造的な連結の形成を可能にしていると考えられる(Figure 12) 。
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イラストは、それぞれのレベルのIPMの基本骨格に関与するHAとhyaladherinの機構を示す。左のパネルは、マトリックスの基本骨格構造を形成する直鎖状HAの、逆並行配置の可能性を示す。b 中央のパネルは、 [Fig. 4] の一番下のパネルで示したようなIPMの電顕像を改作して描いた、細胞外区画の連続した三次元骨格複合体（スケールは正確ではない）である。右のパネルは、IPMと接する細胞表面のHA結合モチーフ（CD44はミューラー細胞頂側微絨毛に存在し、RHAMMはRPE頂側突起の尖端に存在する）やIPM中に分泌された分子（SPACR、SPACRCAN、pigment epithelium derived factor [PEDF]、interphotoreceptor matrix-binding protein [IRBP]）と骨格との相互作用（スケールは正確ではない）を描いたものである。IRBPは食塩水でIPMから取り除けることから、この不溶性IPM複合体の一部とは考えられていない。 （The Cleveland Clinic Foundation 医学イラストレーター David Schumickによる）
b.このシリーズのスコットの総説を参照
謝辞-この研究に使用したヒト組織に対してCleveland Eye Bankに謝辞を述べる。 本研究はthe National Institutes of Health (Bethesda, MD)、The Foundation Fighting Blindness (Hunt Valley, MD)、The Retina Research Foundation (Houston, TX)によるgrantおよびThe Cleveland Clinic Foundationの資金援助を受けた。 このIPMの構築モデルの発展のための研究や討論に関わった同僚、共同研究者を以下に示す：Hugh H. Varner, Peter M-T. Ho, Steven J. Fliesler, Akihiko Tawara, Masayuki Iwasaki, Robert A. Landers, Lifang Tien, Kathy Myers, Matthew M, LaVail, Victoria C. Foletta, Jung Wha Lee, Shreeta Acharya, Ignacio R. Rodriguez, W. Scott Young, III, Ronald J. Midura, Preenie deS Senanayake, Raija Tammi, Markku Tammi, Anthony Calabro, Karen G. Shadrach, Qiuyun Chen, Kazutoshi Nishiyama, Vincent C. Hascall。 妻であるMary E. Raybornの長年にわたる個人的、専門的な支援に特に感謝する。彼女の素晴らしい技術的な専門知識と根気強さなしには、この論文中の画像の多くは生み出されなかったであろう。
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