糖の超微量分析
	(Update Issue: April.23, 2007)
	糖タンパク質やグリコサミノグリカンなどの複合糖質から得られる微量のオリゴ糖を分析する場合，感度が高くかつ優れた特異性を有する検出法と高い分離能を兼ね備えた分析法が必要となる。 金電極を用いるパルスアンペロメトリック検出にラテックス型の陰イオン交換カラムを用いる液体クロマトグラフィーは主に10糖から20糖程度の糖タンパク質糖鎖に対して有効な分析法である(1)。 強アルカリ性移動相を用いると糖の水酸基の一部が解離するので，陰イオン交換カラムにより酸性糖残基の数に加えて単糖組成や結合位置の相違による分離が可能となる。酸化電位を印加した金電極は移動相のアルカリ溶液によってその表面に活性の高い酸化物被膜を生じ，これが触媒となって糖を効率的に酸化するので，その際の電流値の変化を測定すれば糖を検出することができる。この方法は後で述べるプレカラム標識とは異なり，糖試料をそのまま分析できるという簡便性に加えて，糖の水酸基の数に応じた感度が得られるので分子量の高いオリゴ糖ほど高感度が期待できるといった長所をもつが，オリゴ糖を分取する場合はアルカリ性の移動相を用いるためにエピメリ化やピーリング反応の心配がある。 糖の還元末端のカルボニル基を化学的に標識するための蛍光性試薬（図1）が数多く報告されている。その中でも還元的アミノ化反応，すなわちシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)などの還元剤の存在下、芳香族アミンを糖のアルデヒド基に導入し、グリカミンへと導く方法が数多く報告されている（図2参照）。長谷らによって開発された2-アミノピリジンを用いる方法(2)は、高橋らによって2次元および3次元分離へと応用され(3, 4)、逆相系ODS, 順相系アミドカラムおよび陰イオン交換系DEAE-カラムを用いて分離したデータを解析（マッピング）することによりpmolレベルの糖タンパク質由来オリゴ糖を同定することが可能である。しかし、還元的アミノ化法はシアル酸のような酸に不安定な糖残基の脱離が起きる可能性がある上，試薬自体が蛍光をもつため、反応後の過剰試薬を取り除く必要があり、試薬の純度にも注意を払わなければならない。
ABA:2-Aminobenzoic acid 2-ABAD:2-Aminobenzamide 3-ABAD:3-Aminobenzamide ABEE:Ethyl p-aminobenzoate ABN:p-Aminobenzonitrile ACP:2-Amino-6-cyanoethylpyridine AMAC:2-Aminoacridone AMC:7-Amino-4-methylcoumarin ANTS:8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid ANDS:7-Aminonaphthalene-1,3-disulfonic acid AP:2-Aminopyridine APTS:8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid Fig. 1. List of reagents used for labeling of saccharides
Fig. 2. Fluorescent labeling of saccharides by reductive amination
	液体クロマトグラフィーでは分離系における試料成分の拡散が大きく、感度に限界があることから、内径50μm程度のフューズドシリカ管を用いるキャピラリー電気泳動（CE）が台頭しつつある。また，近年では検出感度と特異性を高めるためにレーザー励起蛍光検出が利用されるようになり、感度は飛躍的に上昇した。アミノナフタレントリスルホン酸(ANTS)やアミノピレントリスルホン酸（APTS）で標識した糖は蛍光性に加えて強い酸性基をもつため，CEにおいて良好な分離を示す。特にAPTSについてはGuttmanらによって多くの糖タンパク質糖鎖の分離例が報告されている(5, 6)。一方，ローダミン系色素でラベルした糖のCEにおける検出限界はzeptomolレベル(10-21 mol)に達する(7)など，今後さらに高感度化が進められるものと期待される。
	鈴木茂生（近畿大学・薬学部）
	References (1) Townsend, RR, Hardy, MR, Lee, YC : Separation of oligosaccharides using high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Methods Enzymol. 179, 65-76, 1989 (2) Hase, S, Ikenaka, T, Matsushima, Y : Structure analysis of oligosaccharides by tagging of the reducing end sugars with a fluorescent compounds. Biochem. Biophys. Res. Comm. 85, 257-263, 1978 (3) Tomiya, N, Kurono, M, Ishihara, H, Tejima, S, Endo, S, Arata, Y, Takahashi, N : Structural analysis of N-linked oligosaccharides by a combination of glycopeptidase, exoglycosidases, and high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 163, 489-499, 1987 (4) Nakagawa, H, Kawamura, Y, Kato, K, Shimada, I, Arata, Y, Takahashi, N : Identification of neutral and sialyl N-linked oligosaccharide structures from human serum glycoproteins using three kinds of high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem., 226, 130-138, 1995 (5) Guttman, A : Multistructure sequencing of N-linked fetuin glycans by capillary gel electrophoresis and enzyme matrix digestion. Electrophoresis, 18, 1136-1141, 1997 (6) Guttman, A, Herrick, S : Effect of the quantity and linkage position of mannose(α1,2) residues in capillary gel electrophoresis of high-mannose-type oligosaccharides. Anal. Biochem. 235, 236-239 1996 (7) Le, XC, Tan, W, Scaman, CH, Szpacenko, A, Arriaga, E, Zhang, Y, Dovichi, NJ, Hindsgaul, O, Palcic, MM : Single cell studies of enzymic hydrolysis of a tetramethylrhodamine labeled triglucoside in yeast. Glycobiology, 9, 219-225, 1999
1999年 12月 15日