これはES 細胞（胚性幹細胞）や体細胞からの核移植を行う方法を使ってα1,3GTをノックアウトする方法である。ブタではES 細胞が開発されておらず、ES 細胞を使って相同組み換えを起こす遺伝子ダーゲッテイングは現時点で望めない。しかし、体細胞からブタの卵への核移植の方法がいくつかの機関で確立され⁷、既に2つのグループから線維芽細胞の核を移植する方法でα1,3GTがヘテロでノックアウトされた^8,9。

II-2. 糖鎖合成における競合　（図 1 緑で表示）

α-Gal エピトープを下げる方法についてはいろいろ報告されている。その一つは、β-D-mannoside β-1,4-N-acetylglucosaminenyltransferase III (GnT-III) を使って糖鎖合成をコントロールすることである。これにより細胞表面全体の抗原性を変えることになる。我々は遺伝子導入したブタの血管内皮細胞を使ってこのα-Gal エピトープの減少を示した。GnT-IIIはN-型糖鎖の幹部(コアのマンノース)にN-acetylglucosamine (GlcNAc) を付ける働きがある。そして幹部にGlcNAcを付けると他の糖転位酵素の働きを妨げることになる。つまり、一旦このGlcNAcがGnT-IIIの働きによりN-型糖鎖のマンノースの間にそれらを分ける様に挿入されると、相反する働きを持つα-3-D-mannoside β-1,4- N-acetylglucosaminyltransferase IV (GnT-IV) やα-6-D-mannoside β-1,6- N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) はゴルジ装置のなかで3本側鎖の構造を取り得なくなり、結果的に、この挿入されたGlcNAcがコンプレックスタイプの形成を妨げ、α-Gal エピトープの数は減少することになる。

このGnT-IIIの効果の欠点は、N-型糖鎖が強い抗原性を持つと考えられているが、これにしか効かないことである。従って、O-型糖鎖や糖脂質には基本的に効果がない^14,15。

II-3. 糖鎖末端での基質に対する競合 （図 1 青で表示）

　α-Gal エピトープを抑制する他の方法は、ゴルジネットワークで、α1,3GTと他の糖転位酵素が共通する基質を奪い合うことを利用して、糖鎖末端をフコシル化、シアリル化することである。いろいろな糖転位酵素, α1,2 fucosyltransferase (α1,2FT)、 α2,3 sialyltransferase (α2,3ST)、およびα2,6 sialyltransferase (α2,6ST)にはこの可能性がある。中でもα1,2FTの遺伝子導入はすばらしくα-Galを抑制すると報告されている¹⁶。 Sandrinらはブタの腎臓の線維芽細胞を使った実験で約70 %のα-Galの低下を報告している¹⁷。また、Sharmaらもこのアプローチの有効性をα1,3GTとα1,2FTの両方をCHO細胞に導入することで証明している¹⁸。両者ともこのα-Galを減らす方法がトランスジェニックマウスでもきわめて有効であるとしている。加うるに、α1,2FTを発現するブタは既にいくつかのグループで報じられている。しかし、欠点としては、SeppらはLewis^X　の発現はバックグランドレベルに落ちるが、Lewis^Yという新しいエピトープがα1,2FTのブタの細胞で誘導されることを示している¹⁹。

一方、我々は、α2,3STやα2,6STは、α1,2FTよりも有効にブタの細胞のヒト自然抗体に対する抗原性を下げる事を報告し、加えて、GnT-IIIとα2,3STの共発現で約80 %の異種抗原を下げる事も証明した²⁰。

II-4. GP3ST （図 1 空色で表示）

新しい硫酸転位酵素であるglycoprotein-3-sulfotransferase (GP3ST)は非還元のβ-galactosideを持つ糖鎖にも効き、タイプ 1 (Galβ1-3GlcNAc-R) と タイプ 2 (Galβ1-4GlcNAc-R)の両方の糖鎖に同じ様に効果がある。GP3STの作用は糖鎖末端での競合阻害をおこすα1,2FTやα2,6STと同様にα-Gal エピトープを抑える。また、GP3STの基質特異性はα2,6STとほぼおなじである。

我々の研究では、GP3STによりα-Gal エピトープのような異種抗原を抑制する方法は、α2,6STに近いがα2,6STよりは少し弱く、α1,2FTとほぼ同等であった。また、GP3STは糖蛋白と糖脂質の両方のα-Gal エピトープを抑える効果がある^21,22。

II-5. α-galactosidase 処理 （図 1 紫で表示）

α-ガラクトシダーゼにより細胞表面のα-Gal エピトープを取り除くのは、効果的なアプローチであり、これの遺伝子導入もまた効果的である。しかし、ブタの細胞ではこのα-ガラクトシダーゼは著しい効果を示すが、トランスジェニックマウスではわずかに15-20 %のα-Gal エピトープを下げる効果しか示さなかった。　別の方法としては、α-ガラクトシダーゼとα1,2FTの両方をトランスジェニックすることがα-Gal エピトープを下げるのに効果的だとしている報告がある²³。

II-6. Endo-β-galactosidase C (Endo Gal C) （図 1 桃色で表示）

この酵素はClostridium perfringensの培養液から抽出、精製された。Galα1-3Galβ1-4GlcNAcからなる構造のβ1-4でつながる部位を切ることによりα-Gal エピトープを分解する。In vitro でもex vivoの潅流の際でも効果があり、加えて、このEndo-Gal Cはブタやサルに静注しても重大な副作用はおこさない。この薬はドナー組織の α-Gal エピトープを一時的に抹消するのに便利であるが、現時点ではこれのトランスジェニック動物は出来ていない²⁴。

II-7. その他

糖転位酵素のコンビネーションのアプローチである、α2,3ST と GnT-IIIとか α-galactosidase とα1,2FTとかは既に α-Gal エピトープを抑える効果があることは証明されている。従って、現時点ではGnT-IIIとフコース転位酵素かシアル酸転位酵素、そしてα-galactosidaseなどの３者の混合が異種抗原を落すもっとも効果的な方法かもしれない。言うまでもなく、超急性拒絶反応に打ち勝つ最良の方法は、2、3の補体制御因子を、これら混合して用いる糖転位酵素と同時に発現させなければならないであろう^{20, 25}。

Hanganutziu-Deicher (H-D) 抗原はglycolylneuraminic acid (NeuGc)のことで、ヒトを除くほ乳類に広く分布している。このNeuGcはcytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) 水酸化酵素の活性に依存している。ヒトでこのNeuGcがないのは、CMP-NeuAc　水酸化酵素の遺伝子に部分的な欠損があるからである^26,27。従って、α-Gal エピトープがノックアウトされた後、このエピトープはブターヒト間の異種移植で最大の抗原になる可能性を秘めている。

この抗原を抑制するために、CMP-NeuAc水酸化酵素遺伝子のノックアウトを含め、いろいろな方法が考えられている²⁸。幸いGnT-IIIはなにもα-Gal エピトープに限った効果ではないので、このH-D抗原を下げる可能性はある。

一方、小林らは健康ボランテイアと、ブタの腎臓の潅流を受けた1-3週後の、あるいはブタのラ氏島細胞の移植を受けた1か月後の患者の間でNeuGc-GM3に対するIgG やIgMの平均値に差はなかったと報告している²⁹。

　糖転位酵素のトランスジェニックブタに関しては、４つのグループがα1,2FTのトランスジェニックブタを報告している。最初の報告は名古屋のグループからであった。彼らは実際的にα1,2FTのトランスジェニックブタを作り出したが、それをline化しきちんとした解析をするには至らなかった。次はNextran社からであったが、ブタのシッポのデータを示しただけにとどまった。次はAlexion社からであった。彼らはH2K^bとCMVのプロモーターの両方を使いトランスジェニックブタを作り、多くの組織で高発現を得、主に線維芽細胞でその細胞表面の変化を追っている。ここで、α1,2FTのトランスジェニックブタの血管内皮では50 %の α-Gal エピトープが抑制されている事が示されたが、移植実験は行われなかった³⁰。 この他に、CD55 (DAF)と α1,2FT 、また、CD55とCD59と α1,2FTという組み合わせのトランスジェニックブタの報告がCowanらによってなされた。これは補体制御因子と糖転位酵素のコンビネーションが重要であることの証明であったが、α1,2FTの発現は少なくα-Gal エピトープは有意には落ちていなかった。³¹

他の糖転位酵素に関しては、我々の経験ではα2,3ST およびα2,6STの活性のあるトランスジェニックブタを作るのは困難であることが分かっている。

一方、GnT-IIIの発現はトランスジェニックブタで比較的楽に得られる。トランスジェニックブタでのGnT-IIIの発現は多くの組織や細胞でその表面の糖鎖、特にα-Gal エピトープをハッキリと変化させ、ヒトの自然抗体に対する抵抗性を与えた。このアプローチは抗原性全体のリモデリングとなり、単にα-Gal エピトープだけでなくH-D抗原や他の未知の抗原を制御することにもなる¹²。（図２ )

異種移植の分野における免疫学的障壁はもっと良くわかるようになり、これに対する有効な方法が最近打ち出されている。現時点おいては、ノックアウトしか、α-Gal エピトープを完全になくすことはできない。ブタの血管内皮には約20 x 10⁶のα-Gal エピトープが発現している事を考えると、Galili はこれを95 %下げたとしても異種移植の拒絶反応は防げないとしている。さらに、α1,3GTをノックアウトしても10-30 %の異種抗原はブタの細胞表面に残ることになる³。

異種移植の臨床を成功させるには、異種抗原を除去するさらなる試みが要求されている。