はじめに

細胞外マトリックスの他の成分と区別されるヒアルロン酸(以下HA)の特徴的なマクロ物性は、実験が容易で、すでに50年以上に渡って研究および言及されてきた。しかし、HAの微細構造の理解と、それがどのようにしてマクロ物性を支配しているのかに関してはまだはっきりとわかっていない。我々は本稿で、マクロ物理的挙動の新たな分析を概観し、それを局所的オリゴ糖レベルにおけるHAの挙動を決定する分子間相互作用に関する最新の証拠に関連づけてみる。

マクロレベルにおけるヒアルロン酸の物性

HAが初めて精製されて以来、その特性は、主にタンパク質分析用に開発され、またその特性が完璧なニュートン溶質に近くなることを要求してきた従来の生物物理学的分析に挑戦してきた。 溶液中のHA挙動は、たとえ低濃度にあってもニュートン的あるいは「理想的」挙動からかけ離れているばかりか、研究を進展させるためにはSandy Ogston、Torvard Laurent、Endre (Bandi) Balazs そして後にはBob Clelandといった一流の研究者たちの頭脳をも要した。彼らの研究こそが、HAの特徴的な性質を理解し始めるための確固とした根拠をもたらした理論的・実験的な枠組みを確立した^1-3。このシリーズのHascall, Laurent による「ヒアルロン酸：その構造と物性」およびLaurent の「20世紀におけるヒアルロン酸研究―発展の系統樹―」を参照されたい。

明らかにされたされたHAの主な特性は下記の通り：

ヒアルロン酸拡散の共焦点FRAP分析

1990年代後半になってから、Hardinghamと共同研究者たちは、溶液中の特性を分析するための新しい手法を開発することでHA研究を大きく前進させた。
この手法は、溶液中のFITC標識HAの側方並進拡散を測定する共焦点FRAPに基づいていた^5-7, (Figure 1)。この技法は、濃度、pH、イオン強度そして温度といったHAの流体力学的挙動を左右する要素も見極めることを可能にした。分子間相互作用の強弱を判断する上でこの技法が特に重要だったのは、高濃度溶液および希釈溶液のどちらにも対応できることであった。また平衡技法であるため、他の生物物理学測定に大きく影響する濃度勾配と移動境界がない。結果は、高濃度におけるポリマーの絡み分子を反映する、良溶媒中のポリマーの自己拡散のために確立された経験的関係に基づいて⁸解釈することができる。さらに、HAの分子ドメインへの影響は、同値寸法の球形としてのHAの流体力学的挙動を表すStokes-Einsteinの式を使ってモデル化が可能だ⁹。したがって、高濃度と低濃度の両方の自由溶液中の平衡状態でのHAの流体力学的挙動と分子間相互作用の研究を行うのにまさに理想的であった。これにより、濃度が高くなるにつれてHA分子ドメインが「混雑し」重なり合っていく際に起こるHAの個別分子特性、分子間相互作用そしてネットワーク形成特性に幅広い特徴付けをすることができた。HAの自己会合を研究していく上で後者がもっとも重要であったのは、弱い鎖間相互作用が関係している可能性があったからである。何故なら高濃度では鎖は溶液中で狭い間隔に並ぶはずで、たとえ微弱であっても鎖間の相互作用が存在していると十分に考えられたからであった。共焦点FRAP技術はまた、高分子化合物の濃溶液が、より小さな分子サイズの溶性のFITC標識されたトレーサー拡散を妨げるのを分析することが可能で、トレーサー拡散測定に適していた⁹。これは濃溶液中の高分子化合物によって形成された「ネットワーク」の見た目の細孔子の大きさの測定を可能にした。

濃度の上昇に伴うHAの並進拡散における変化に対する初期の分析は、溶液中の絡みによって表される特性を見せた(Figure 2)。これは溶液中のすべてのポリマーに共通する特性である⁸。これは、例えば水といった良溶媒に溶解したポリマーとしてのHAが、良溶媒中の他の高分子化合物と同様な行動をとったことを示唆し、つまり高濃度における分子間相互作用の証拠は、絡み以外にはなかった。イオン強度の影響も、溶液のイオン強度を下げるにつれて、HAの流体力学的容積は大きな膨張を見せたことによって同じくらい有益な情報を提供した(Figure 3, 4).¹⁰。これは、流体力学的ドメインの拡大を引き起こす、HA鎖上の隣接するカルボキシル基の電荷反発の高分子電解質効果を反映した。この結果は、HAが高度に伸展した流体力学的ドメインを持った高分子化合物であることを立証すると同時に、過去に確立された硬いランダムコイルのモデルとも完全に一致していた。絶対的な特性は、極めて分子量依存的であり、HAのほとんどの特性は二糖分子10,000にも及ぶその鎖の長さゆえ顕著であることを証明した。

HAの拡散挙動は、pH4-8という広範囲ではほとんど変化は見られなかった。しかしながら、強アルカリ溶液（pH 12-14）では、流体力学ドメインは縮小したようで、つまり鎖を硬化させる要因は何であれ高pHでは失われたが(Figure 4)、実験時の状況下ではHAの解重合はほとんど見られず、pHを下げていくにつれて元の性質に回復した⁶。アルカリの影響はおそらくは、HAのいくつかのヒドロキシル基グループがイオン化していくことに起因すると考えられる。興味深いことに、それはHA脱イオン水中の分子ドメインの1％未満にまで減らし(Figure 3)、HAの特性は同様の分子量のデキストランのそれと類似するものに変化した。HAの自己拡散の温度依存性の研究は、とりたてて大きな成果は得られず、温度による水の粘度の変化と相関する拡散係数になめらかでわずかな変化を見せただけだった。結果は、鎖間会合があった場合に予想される、いかなるHAの分子間相互作用の熱融解の証拠を示さなかった。HAオリゴ糖との競合実験においても、鎖間会合の形跡はなかった。鎖間相互作用を通してのHA分子の自己会合がHAの拡散を弱めるのに対し、短いオリゴ糖との結合が拡散率に影響するとは考えにくい。この場合、オリゴ糖は鎖間相互作用の競合物質としての機能を果たすべきだが、HA自己拡散にはまったく影響がなかった。あらゆる影響の不在は、HA水力学的特性は鎖間競合に影響されなかったことを証明している⁹。

HA高濃度溶液中 (930 kDa と >1 mg/ml) のFITC標識デキストラン(2 MDa)のトレーサー拡散を分析すると、拡散の濃度依存的な減少⁶が見られ、濃度を1mg/ml から10 mg/ml に上げると、平均的細孔サイズである135nmが30nmにまで縮小するモデルを作ることができる。 こうした特性は広いpH領域中(pH 4-8)ではほとんど変わらず、またイオン強度でもわずかな変化しか見せなかった⁶。その理由は、鎖の濃度がイオン強度に対して不変であるため、トレーサー分子の拡散の減少の主要決定要因である溶液中の鎖密度に変化がないためである。 イオン強度が低くなるとHA流体力学ドメインが拡張し、自己拡散が縮小するにもかかわらず、濃度がｃ*以上(個々の分子ドメインが重なり始める濃度)である限り、鎖密度への影響はない。分子ドメイン内で鎖密度が高い領域だけでなく、分子ドメインに鎖のない領域が存在しているため、濃度がｃ*以下のHA溶液は不均一である。従ってｃ*以下のHA溶液のトレーサー拡散率は、HA分子ドメイン外の自由拡散率とHA分子ドメイン内の減少率の時間平均となる。ｃ*以下の濃度になると、分子ドメインはイオン強度が低いと増大し、高いと減少する性質を持っていることから、イオン強度がトレーサー拡散に大きな影響力を持つ。

もし細胞間マトリックス内のHA濃度がｃ*を上下するようなことがあると生理学的影響が出るうえに、HAの分子量の変化によってさらなる生理学的影響がでると考えられる。もしHAが分解された場合には、その分子量と水力学的ドメインが縮小される。そうなるとドメイン重複のために必要な濃度、つまりc*は、増大する。従ってたとえ濃度に変化がなくとも、分解が起こると高分子量HAにとってはc*より上に、低い分子量のHAにとってはc*より下の濃度に切り替えることができる。そしてこれは細胞間マトリックスネットワークを通じてHA自己拡散率および他のマクロ分子の拡散率を増大させる。
こうして組織内HAの分解は、たとえその濃度の低下がなくとも、細胞から細胞へとシグナルを運んでいくマクロ分子のECMを通じることによりアクセスを増大させる。

HAを分析する上で共焦点FRAPを使用するにあたり、一つの条件下でのみ自己会合のわずかな証拠があり、それは何年も前になされた見解と大いに関連していた。かねてよりHAは、溶液がpH 2.5に調節されると粘弾性のある「パテputty」を形成すると報告されていた¹¹。この効果はこのpHに非常に特有であり、pH 3.0以上でもpH 2.0以下でも観測されなかった。共焦点FRAP分析においては、pH 2.0およびpH 3.0と比較すると、pH 2.5では自己拡散の急激な減少が見られた。興味深いことに、pH 2.5ではHAのトレーサー拡散が増加するという現象が同時に見られた¹²。この2つの観測結果、つまり低自己拡散と高トレーサー拡散は、このpH条件下で鎖間会合が起こるモデルと一致している。なぜなら、鎖の会合は一時的に分子間結合を作って自己拡散を減小させるからである。さらに鎖間会合部位の形成は、不規則な鎖の局所分布を作り出すが、これによって平均より大きめの細孔サイズを生み出すため、トレーサー拡散が増大する¹²。pH 2.5におけるHAのパテ形成の分子的説明は不明だが、このpH条件下おけるカルボキシル基の部分的プロトン化が係わっているのではないかと推測されている。しかし最も興味深いことは、予測された自己会合が共焦点FRAPにより検知されたことである。pH2.5条件下で検知された通常と異なるHAの挙動は、より生理学的pH条件下においても、またどのイオン強度あるいはHA濃度でも、類似の鎖間会合は存在しないことを確実に立証する手だてとなった。

このことからもわかるように、HAは普通の挙動を示す、大分子量ポリマーであり、純粋溶液中では硬いランダムコイルとして挙動し、分子の絡み合いによって決まる粘弾性溶液の形成の原因となる極めて大きな水力学的ドメインを持っている^10,12。
これらの特性は、その機能の一つとして大空間を占める水統御ポリマーとして作用し、同時に他の生物活性分子が複数列に組み立てられる多価の骨組みを提供し、タンパク質と多くの高度に選択的な相互作用に関与するという、HAの生物学的特性と一致している。

局所分子レベルにおけるHAの構造と動力学

過去にHAの研究者は、実験結果から分子レベルにおいては、HAは完全に非拘束的なポリマーではないという結果に辿り着いた。例えば、ポリマーは低濃度では自由に屈曲できるランダムコイルとは一致しない粘弾性溶液を形成し、そしてHAの過ヨウ素酸酸化は予測よりももっとゆっくりと起こる^13.14。しかしながら、多くの実験結果はHAには局所的な剛構造は存在しないとも示している。HAは高濃度まで可溶であり、凝固せず、弾性ゲルの形成に抵抗し、鎖間会合が見られない⁹。共焦点FRAP(上記参照)などの技術から得た最近の結果もこれを裏付けている。では、我々はどうすればこの2つの見解を両立させることができるのだろうか？そこで我々は、その3次元構造において平均的な局所構造秩序は持つものの、その平均構造の周囲でかなり動的屈曲を見せる分子によって、これらの結果を説明できると仮定してみた。我々はここでこの構造的仮説が、分子力学(molecular dynamics：以下MD)計算や、核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance：以下NMR)による実験データの両方と一致し、同時にHAのバルク特性と、その生理学的挙動と機能の説明もできると主張したい。

従来のヒアルロン酸の3次元構造研究

HAの3次元分子構造を最初に垣間見ることができたのは、1970年代の配向線維のX線散乱からだった¹⁵。単一の、明確な配座ではなく、環境因子(例：イオンの種類、鎖の水和レベル)により回折パターンで劇的な変化が見られた。線維の回折パターンを分析することで、分子のらせん対称を決定でき、かつ、好ましい事例では分子の3次元構造の基本モデルの作成も可能となる。HAの場合には、0.8〜1.0nmピッチの2-、3-および4回軸の左巻きらせんが確認された(本シリーズSheehan and Almond, ヒアルロン酸：静的、流体力学的および分子動力学的見地より参照) ¹⁶。大多数の場合、単位格子は平衡して一本鎖を包含するが、特定の条件下になると逆平衡配座で単位格子１つにつき鎖が2本観測される。まず、単位格子の形がそこに存在しているイオンの種類に大きく影響されている可能性があるが、これは溶媒シェルが異なるイオンと係わり合いを持っているからではないかと結論された。2つ目としては、X線回折と一貫していたモデルでは糖ユニット間の分子内水素結合のはっきりした可能性を頻繁に持っていた。3つ目は、線維回折パターンのすべてが存在可能なモデルの構築に使用できるわけではない。たとえば低pHで観測された2回軸のX線回折パターンは、完全に精緻化されなかったことからもわかるだろう¹⁷。従って、X線回折によって生成される精緻化された構造は、非生理学的条件の下で実施されており、結晶化条件のアーテファクトである可能性があるため、細心の注意と共に取り扱われるべきである。

文献によれば3回および4回軸らせんは最も広い範囲下で発見されているが、ほぼ間違いなく最も生理学的(水和化したナトリウムイオンの)条件が整っていると発見されるのは4回軸らせんである¹⁸。これらのデータに基づき、溶液中で最も起こり得そうな配座は分子内水素結合を伴う3回もしくは4回軸の左巻きらせんで、HA溶液観察によって支持されている(水力学的観察からわかった、HA鎖の遅い過ヨウ素酸酸化と局部剛性など)。さらにHAの多数の結晶形態を観察した結果、HAは溶液中では局所的に動的である可能性を示し、このことはHAが高濃度でも粘弾性を保ち、切断可能なゲルを形成しないという事実に裏付けされている。

コンピュータシミュレーションによるコンフォメーションと動的力学の研究

X線回折研究はHAの可能な局所配座に対する重要な洞察を提供する一方で、直接的に原子レベルでの情報を提供しないため、結局は限界がある；得られた分子像は静的であり、HAの生理学的機能への理解への適切さは限られている。こうした限界を克服する手だての一つとしては、分子動力学(以下MD)シミュレーションなどといった近代コンピュータ手法の導入が挙げられる。こうした手法は、理論的(量子力学に基づく)もしくは実験的(分光学)手法から計算された、一般的な経験的パラメータを使って分子のポテンシャルエネルギーの計算を試みる。こうしたポテンシャルエネルギーを使用することによって局所の最小エネルギーをとる立体配座が計算できる。しかしながら、現実的な自由エネルギーは分子エントロピーを考慮することでのみ入手でき、それにはポテンシャルエネルギー表面に沿って分子を動かすMDシミュレーションを要する。さらに、HAのような糖質は水との強い分子レベルでの相互作用があることを、分子内水素結合力学を理解する上で明確に検討する必要がある。このようなシミュレーションは、たとえHA４糖類でさえ数千もの原子を考慮しなければならないため計算量を必要とし、可能となったのは比較的最近のことである。

基本的なコンピュータ計算は、X線回折研究によって発見された典型的な左巻きの形状が、糖鎖同士の結合のための最低エネルギー構造と一致することを示す¹⁹。このような形状においてはどちらの単糖間の結合でも水素結合が存在することができる。これは局所エネルギーを低下させかつ構造を安定化させる役割を持つ。どちらの単糖間の結合部においても、ヒドロキシル基から水素結合が形成される(隣接する環状エーテル酸素とOH3あるいはOH4間で)。さらに1-4結合部では、(力の加わった)水素結合が隣接のカルボキシル基アミド基から形成される可能性がある。一方、1-3結合部では、カルボニル酸素とOH2位ハイドロキシル基の間で水素結合が形成されることがある。結果として得られた低エネルギー構造は、(X線回折研究と比較して)比較的収縮したピッチの2糖を持つ、左巻き３もしくは4回軸らせんと一致する。そのような構造は水分子存在下の条件でMDシミュレーションを行う場合の基盤として使うことができる(Figure 5)。

HAオリゴ糖のコンピュータモデルが、1滴の水に入れられ、生理的温度にまで加熱されると、水分子はHA分子の表面で水素結合し、分子内水素結合を除去する。特に、例えば、水分子はアミドとカルボキシル基の間に入り込む。その結果、直感に反して、分子は実際にさらに伸展する²⁰。 こうした水溶性シミュレーションでは、局所配座は二糖類を基本単位とした、平均で約4回軸らせんであることが発見された²¹。このような4回軸らせんは0.96 nmという平均的な二糖類の長さ(一つおいた隣に隣接するグリコシド酸素原子の間)を有し、平均して0.84 nmの平均的軸高を見せる(Figure 6)。この平均的構造はprotein data bank　(http://www.rcsb.org/)　からコード「2BVK」でダウンロードできる²²。

さらに動的構造を数値化する上で、便宜上ここでは軽(水素)原子を介して定義されるグリコシド結合の研究が役立つ。従って、φ角はH1-C1-O-C´、ψはC1-O-C´-H´と定義される；他の重原子定義は120を足すか引くかで求めることができる(下記参照)。この命名法を用いることで、1-3結合の平均的(φ、ψ)角度は(50.7, 9.7) であり、1-4結合は(47.9, 8.0)である；どちらの結合タイプも(f, y) = (50, 10)周囲の比較的狭い領域に(標準偏差±13)限定されている。

分子内水素結合の頻度はシミュレーションの時間ステップ幅を使い、水素結合をフィルターで検出する、簡単なアルゴリズムによって監視することができる。相応のフィルターとしては原子間距離0.35 nmで120より大きな角度(D-H-A)を持つ電気陰性物質原子のドナー(D)とアクセプター(A)（この場合、いずれかがOあるいはN）である。シミュレーションの途中で2糖当たり4つの分子内水素結合が見られ、そのすべてが溶媒水分子との急速な(フェムト秒単位)交換をおこなっている(分子内水素結合内で時間の40%未満を費やす)と予測され、それは局所的な鎖の柔軟性の原因となる(Figure 7)。発見された水素結合はX線線維回折研究と基礎的分子モデリング(上述)によって定義されたものと類似している。繰り返すと、1-3結合部ではOH2はカルボニル酸素に、そしてOH4は隣接の環酸素へ結合し、1-4結合部ではアミンはカルボキシル基に、OH3は隣接の環酸素へとそれぞれ結合する。

動力学予測と実験データとの比較

IUPAC命名法(X線回折の文献に使われている)平均予測ねじれ角は次の通り：1-3結合 C1−O3−C3−C4は128.5、O5−C1−O3−C3は-68.1、1-4結合C1−O4−C4−C5は-112.2そしてO5−C1−O4−C4は-71.1である。 この平均的コンフォメーションは、ナトリウムイオン存在下の線維から得られた斜方逆並行左巻き4回軸らせんとして決定されたX線回折像に近い。シミュレーションによって予測された２糖当たりの平均軸高(約0.84 nm)は、固相HAで観察された最も収縮したらせんの一つである、これらのモデルと矛盾しない。回折パターンから得られたカリウムあるいはヒアルロン酸カルシウム線維はこの平均よりもさらに長く、それらは0.89−0.95 nm範囲の軸高を持つ4回軸らせん鎖と、左巻き逆並行3回軸および4回軸らせん鎖を含む正方晶および斜方晶ユニットセルと特定された。こうした回折パターンから得られたコンフォメーションはシミュレーションから予測された平均構造と一致しないが、前述のように動的変動ではうまく提示されている。しかし、HAの生物学的性質の基盤であると定義されている0.98 nmの軸高を持つ伸びた2回軸らせんは過渡的にしか起きず、1、2の2糖にわたる短いHA鎖に限定されている。

コンピュータモデルにより得られたHAのより生理的溶液条件下における3次元情報の特異的証明は、同位元素で標識したオリゴ糖のNMR研究から得られた。（タンパク質などのように）¹⁵N-原子核はオリゴ糖内での位置に敏感であり、すべてのアミド基はすべて10糖からなるオリゴ糖内で同定することができた²³。これは従来分析可能であった最大糖サイズ、４糖類(ポリマーとしてははあまりふさわしくないモデル)、より大きな進歩である。オリゴ糖の部位特異的位置において高感度緩和実験を実施することにより、結合角は、シミュレーションでは13と予測されていた標準偏差に近い約18 の標準偏差内にあることが推定できる²⁴。さらに、NMRカップリング値の部位特異的測定は、トランス(HN-N-C2-H2)から出るアセトアミド側鎖の回転運動の平均角度から約24の標準偏差を示し、これも18というシミュレーションからの推論に近い(Figure 8)。各アミド水素から隣接の環水素原子まで測定された特定のNOESY法NMRのクロスピースもまた、以前に提唱された伸展した二重構造よりもむしろ、平均トランスおよび収縮したHA局所構造のアセトアミド基と一致している²²。

これらと同様に標識したオリゴ糖を用いることによって、オリゴ糖のすべての位置のアミドプロトン化学シフト摂法、カルボキシレート基pKa値、アミドプロトン温度係数および化学交換速度を確認することができる²⁵。こうした観察は、アミド基とカーボキシレート基との間の高密度水素結合と一致しないことがわかる。高分子HAとオリゴマーの特性を比較してみると、8糖類およびポリマーの中心とアミドプロトン環境との間には、明確な違いがないことを示唆し、これはまた3次構造の形成と矛盾している²⁶。従って高密度分子内水素結合に依存する2次および３次構造モデルの２つの主要な側面は、微細的視点からは正しくなさそうである。

こうした結論は、アミド基の局所力学は、近接のカボキシル基の存在に比較的影響を受けず、1-4結合を越えてのアミド基とカルボキシル基の間には強く、持続的な水素結合が存在する証拠は発見されなかったことを示唆するシミュレーションに符合している。その代わりに、この2つのグループはお互いに近接しており、局所的水分子と急速に交互置換する(強い相互作用は4％の時間でのみ存在した)弱い、過渡的水素結合を通じて相互に作用し合うと推定される。この解釈は、上述した実験観察と一致しており、分子内水素が結合存在する時でも、5−15%以上の時間では存在できないことを示唆している。

こうした相互作用は、HAオリゴ糖のコンフォメーションをほぼ4回軸の構造に維持するが、相当の局所力学を持っており、水分子の関与によりグリコシド結合により柔軟性をもたらし、比較的大きく、急激なコンフォメーション変化を可能にする。こうした解釈は、NMRとX線回折による微視的実験と一致しており、また、溶液中の硬くなったランダムコイルとしてのHAの流体力学的巨視的挙動とも一致する。

結語

特異で独特なHAポリマー溶液の性質がかなり以前に確立されたが、新しい方法によってそのマクロ高分子レベルにおける分子挙動をより明確に定義できるようになり局所および原子レベルにおけるその挙動を数量化・モデル化できるようになったのはごく最近である。そしてそれはHAの特徴的なマクロスケール特性が、その局所構造と、周囲の水やイオンとの相互作用から、いかにして生じるかの明確な理解へとつながっていった。

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