エンド型グリコシダーゼを用いたN-グリコシド糖ペプチドの合成
	糖ペプチドを化学合成することは難しい。ペプチドの化学合成については難しくはないが、長い糖鎖の化学合成は複雑であり、両者を結合することは困難である。それ故にエンド型グリコシダーゼの糖転移活性を利用した化学-酵素合成法（chemo-enzymatic method）は糖ペプチドの合成法として最も有効である。 　エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（endo-β-GlcNAc-ase）は糖タンパク質のアスパラギン残基に結合するN-グリコシド結合型糖鎖のタンパク質との結合部にあるジアセチルキトビオース部分（GlcNAc-GlcNAc）に作用して糖鎖を遊離するエンド型グリコシダーゼで、タンパク質側にN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）一残基を残すと言う特徴的な作用を示す。 　N-結合糖鎖-GlcNAc-GlcNAc-Asn-タンパク質　＋　H2O　→　 　　　（アスパラギン結合糖鎖） 　　　　N-結合糖鎖-GlcNAc　＋　GlcNAc-Asn-タンパク質 Mucor hiemalis 由来およびArthrobacter protophormiae 由来の endo-β-GlcNAc-ase である Endo-M や Endo-A は加水分解活性によって糖タンパク質のN-グリコシド結合型糖鎖を遊離するとともに、GlcNAc あるいは GlcNAc を含む化合物の存在下ではこれらを受容体として、遊離した糖鎖を転移付加する糖転移活性を有している（１，２）。 　N-結合糖鎖-GlcNAc-GlcNAc-Asn-タンパク質　＋　GlcNAc 化合物 　　　（アスパラギン結合糖鎖） 　　→　N-結合糖鎖-GlcNAc-GlcNAc 化合物　＋　GlcNAc-Asn-タンパク質 このendo-β-GlcNAc-ase の糖転移活性を用いて糖ペプチドを化学-酵素合成する（３）（図１）。 　まず、第一段階はペプチドのアスパラギン残基にGlcNAcを付けた N-Acetylglucosaminyl peptide を合成するための材料であるGlycosylasparagine の化学合成である。即ち、GlcNAc のアジドとFmoc（9-fluorenylmethyloxycarbonyl）-アスパラギン酸のブチルエステルを材料としてトリエチルホスフィンの存在下で反応を行い、得られたFmoc-Asn(GlcNAc(OAc)3)-OBut を脱アセチル化後、トリフルオロ酢酸によって加水分解して、Fmoc-Asn-GlcNAc を合成する。第二段階は、これをFmoc-Asnに代わる材料として用いて、Fmoc-アミノ酸を材料としたペプチドの固相合成を展開し、N-Acetylglucosaminyl peptide を得る。第三段階はendo-β-GlcNAc-ase （Endo-MやEndo-A）の糖転移活性を用いたN-グリコシド結合型糖鎖の付加で、N-Acetylglucosaminyl peptide に糖鎖供与体（糖タンパク質や糖ペプチド）からN-グリコシド結合型糖鎖を転移付加して糖ペプチドを合成する。反応生成物は逆相カラムを用いたHPLCによって分離する。 　この化学-酵素合成法によって生理活性ペプチドであるカルシトニンの糖ペプチドなどが合成された（４）。さらに、アスパラギン残基の代わりにグルタミン残基にGlcNAc を導入することにより、グルタミン結合糖鎖を有する糖ペプチドの合成も可能であり、生理活性ペプチドのサブスタンスＰの糖ペプチドが合成されている。
Fig.1 Chemo-enzymatic Synthesis of Glycopeptide Using Transglycosylation Activity of Endo-β-GlcNAc-ase
	山本 憲二（京都大学大学院生命科学研究科）
	References (1) Yamamoto K, Kadowaki S, Watanabe J, Kumagai H, :Transglycosylation activity of Mucor hiemalis endo-β-N-acetylglucosaminidase which transfers complex oligosaccharides to the N-acetylglucosamine moieties of peptides.Biochem. Biophys. Res. Commun. 203, 244-252, 1994 (2) Takegawa K, Tabuchi M, Yamaguchi S, Kondo A, Kato I, Iwahara S, : Synthesis of neoglycoproteins using oligosaccharide-transfer activity with endo-β-N-acetylglucosaminidase. J. Biol. Chem. 270, 3094-3099, 1996 (3) Yamamoto K, Fujimori K, Haneda K, Mizuno M, Inazu T, Kumagai H, :Chemo-enzymatic synthesis of a novel glycopeptide using a microbial endoglycosidase. Carbohydr. Res. 305, 415-422, 1998 (4) Mizuno M, Haneda K, Iguchi R, Muramoto I, Kawakami T, Aimoto S, Yamamoto K, Inazu T, : Synthesis of a glycopeptide containing oligosaccharides: chemoenzymatic synthesis of eel calcitonin analogues having natural N-linked oligosaccharides. J. Am. Chem. Soc. 121, 284-290, 1999
2001年 9月 15日