Apr 01, 2026

ドリコール結合糖鎖のホメオスタシス／品質管理に関する研究
[2025年度 東京糖鎖研究会 (GlycoTOKYO) 奨励賞受賞研究]
（Glycoforum. 2026 Vol.29 (2), A4）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.29A4J

シェンタオ・リ（李 盛陶）

シェンタオ・リ

氏名：シェンタオ・リ（李 盛陶）
理化学研究所 開拓研究所（PRI） 糖鎖代謝生化学研究室 研究員
2018年に中国の江南大学で博士号を取得後、博士研究員として理化学研究所開拓研究所に勤務。2025年に理化学研究所の研究員に就任。主な研究対象は、N型糖鎖の生合成および分解。

1. 抄録

最も重要なタンパク質の翻訳時／翻訳後修飾の一つであるN型糖鎖付加は、小胞体（ER）膜上におけるドリコール結合糖鎖（DLO）の構築から始まる。真核細胞にはほとんどDLOが蓄積しないが、ある遺伝学的、または環境条件によっては、未成熟および成熟したDLO構造が蓄積するため、異常なN型糖鎖付加のリスクが増加する。本稿では、このようなDLOの分解に関与するDLOピロフォスファターゼをコードする新規遺伝子の同定について解説する。

2. はじめに

真核生物におけるアスパラギン（N型）糖鎖付加は、ALG（asparagine linked glycosylation）遺伝子にコードされた糖転移酵素群が、小胞体（ER）膜上においてドリコール結合糖鎖（DLO）前駆体を順次構築していく多段階のプロセスから始まる1。構築が終わると、オリゴ糖転移酵素（OST）のはたらきにより、コンセンサス配列Asn-X-Ser/Thr（XはProを除く任意のアミノ酸）内のアスパラギン残基上に、N-グリコシド結合を介してGlc3Man9GlcNAc2オリゴ糖が新生ポリペプチドへと転移する2,3。

1970〜1980年代以降、N型糖鎖の合成は遊離オリゴ糖への分解を伴うことが示されてきた。この過程で生じる遊離オリゴ糖は、中性オリゴ糖（NOS）およびリン酸化オリゴ糖（POS）に分類される4。その後数十年の研究により、DLOに対するOSTの加水分解活性によりNOSが生じること（図 1 ①）や、Ngly1がミスフォールドされた糖タンパク質からオリゴ糖を除去すること（図 1 ②）、ピロフォスファターゼ（DLO-PP’ase）のはたらきによりDLOからPOSが生じること（図 1 ③）が次第に明らかになった5。DLO-PP’ase活性は、酵母および哺乳類のいずれにおいても検出されており6-13、その活性は主に哺乳類細胞のゴルジ体で認められている14,15。しかし、この酵素をコードする遺伝子については、どの生物種においても謎のままであった。

最近の研究では、POSが主にDLO生合成の異常時に蓄積する未成熟なDLO中間体に由来するものであることが示されている。具体的には、先天性グリコシル化異常症I型（CDG-I）患者由来細胞16,17や、グルコース飢餓環境あるいは2-デオキシグルコース処理下の哺乳動物細胞18,19を用いた研究により明らかにされている。これらの結果が示唆しているのは、POSの産生がDLO生合成と密接な関連を持つ厳密に制御されたプロセスであるということ、またDLO-PP’aseの遺伝子情報なしにその生理機能や調節メカニズムの詳細解明は叶わないということである。我々は、最近発表した研究の中で、酵母のDLO-PP’aseであるLlp1を同定するとともに、ERに蓄積したDLOがゴルジ体へ移動してLlp1に分解されるという新たなDLOホメオスタシス／品質管理メカニズムを提案した20。

図1
図 1. N型糖鎖の合成は遊離オリゴ糖への分解を伴う

3. 酵母と哺乳類細胞で異なるDLO-PP’aseの遺伝子

DLO-PP’aseを同定するため、我々はDLO-PP’ase活性を検出するin vitroアッセイを開発した。まず、DLO-PP’ase活性を有する酵母または哺乳類のミクロソームを界面活性剤で可溶化し、DLO（Man5GlcNAc2-PP-Dol）と反応させることで、POS（Man5GlcNAc2-P）を生成した。得られた Man5GlcNAc2-P は、陰イオン交換法により精製し、アルカリフォスファターゼ処理を行った後に蛍光標識（2-アミノピリジン）し、HPLCにより分析した（図 2）。酵母（S. cerevisiaeおよびS. pombe）およびヒト細胞（HAP1）由来ミクロソームのDLO-PP’ase活性を比較した結果、二価陽イオンの作用に関して酵母とヒトの酵素の間で異なるパターンが認められた（図 2）。この知見は、酵母と哺乳類のDLO-PP’aseが異なる遺伝子にコードされている可能性を示唆するものである。

図2
図 2. In vitroのDLO-PP’aseアッセイ法の確立

4. 酵母においてDLO-PP’aseをコードしているLLP1遺伝子

酵母DLO-PP’aseをコードする遺伝子を同定するため、酵母ミクロソームを材料として酵素を精製した。酵素の部分精製後、精製タンパク質画分のショットガン解析を行い、酵母の遺伝子欠損株ライブラリから候補遺伝子を選別し、当該欠損株のスクリーニングを実施した。このようにして選択した遺伝子変異体候補の1つYJR112W-AΔは、細胞内にPOSが認められず、DLO-PP’ase活性も有していなかった。このYJR112W-A遺伝子をLLP1（lipid-linked oligosaccharide pyrophosphatase）と命名した。

5. 翻訳フレームシフトによる機能的Llp1タンパク質の生成

LLP1（YJR112W-A）はSaccharomyces Genome Database（SGD）上で、イントロン領域を有する遺伝子として登録されている（2026年1月現在）。しかし、我々はイントロンを欠失させたタンパク質に活性がないことを確認したため、イントロン領域のアノテーションが不正確であったことが考えられた。リボソームプロファイリングのデータを解析したところ、LLP1が酵母レトロトランスポゾン遺伝子のように、プログラムされた+1フレームシフトを使用していることを発見した。この現象は、CUUAGGCモチーフ（LLP1のC64–C70）で起きる。利用可能なtRNAArgCCUが少ないために0フレームのAGG（希少コドンの1つ）で翻訳が一時停止し21,22、リボソームのP部位においてCUUからUUAへとtRNALeuUAGの+1スリップが起きる（図 3）23,24。これらの結果から、LLP1においてtRNAのスリップが生じることにより、プログラムされた+1の翻訳フレームシフトが起きることが示唆された。

図3
図 3. LLP1においてtRNAのスリップによって生じるプログラムされた+1翻訳フレームシフト

6. 一部の原核生物および真核生物における新規DLO-PP’ase Llp1の保存性

Llp1タンパク質の配列を解析したところ、Llp1がVanZ-likeファミリータンパク質に属していることが明らかになった。VanZファミリーの系統学的分布を調べると、グラム陽性細菌や広範な真菌において広く保存されていることが確認された（図 4）が、調べた範囲で植物や脊椎動物には存在していなかった。VanZ遺伝子が初めて同定されたのは、臨床的に分離されたEnterococcus faecium BM4147であり、この菌株はグリコペプチド系抗生物質であるバンコマイシンへの耐性を有している25-27。DLOが細菌のLipid IIと構造的に似ていること（図 4）から、VanZがLipid IIの切断に関与している可能性が高いと考えられた。

図4
図 4. 一部の原核および真核生物における新規DLO-PP’ase Llp1の保存性

7. Llp1タンパク質はゴルジ体に局在し内腔側に活性部位をもつ

生物種間におけるVanZファミリータンパク質のホモロジー比較およびアラニンスキャニングによる保存残基への変異導入により、我々は保存されたドメインをいくつか同定した。AlphaFold version 3.028を用いてLlp1（S. cerevisiae）の3次元（3D）モデルを予測したところ、これらのドメインは膜の片側に局在し、正および負の電荷をもつ残基を多く含んでいることからフォスファターゼ活性部位を構成している可能性が示された（図 5）。TEVプロテアーゼ保護アッセイの結果からは、Llp1タンパク質のNおよびC末端が細胞質側にあり、Llp1の活性部位が内腔側に存在していることが明らかになった（図 5）。スクロース密度勾配分画法を実施したところ、Llp1の分布がゴルジ体マーカーであるVan1に類似する一方、ERマーカーのSec61とは異なっていた（図 5）。これらの結果は、Llp1が主にゴルジ体画分に局在していることを示唆するものであり、哺乳類DLO-PP’aseの局在性14とも一致する知見である。

図5
図 5. Llp1タンパク質はゴルジ体に局在し内腔側に活性部位をもつ

8. Llp1はDLOのホメオスタシス／品質管理に関与する

DLOの生合成がERで行われている一方、Llp1はゴルジ体に局在している。このことから考えられるのは、ERにあるDLOがゴルジ体へと移行する必要があるということである。ゴルジ体におけるDLOの存在は報告されていないが、生化学的研究によると、ラット肝臓では、ゴルジ体にドリコール／ドリコール脂肪酸アシルエステルがERの約10倍存在しているほか、ゴルジ体に大量のドリコールリン酸が存在することが確認されている29,30。我々は、正常状態下ではLlp1がゴルジ体のDLOを即座に分解しているのではないかという仮説を立てた。これを検証するため、llp1Δおよびllp1Δ alg3Δ株のDLO構造を調べた。意外なことに、llp1Δおよびllp1Δ alg3Δ細胞において、ゴルジ体マンノシルトランスフェラーゼによる修飾を受けたDLO構造が認められた（図 6）。これらの結果から、DLO生合成はERで行われているが、過剰あるいは構築が不完全なDLOがゴルジ体へと移行し、Llp1により除去されていることが示唆された。したがって、Llp1はDLOのホメオスタシス／品質管理に一定の役割を果たしていると考えられる（図 6）。

図6
図 6. Llp1はDLOのホメオスタシス／品質管理に関与する

9. 結論

以上の通り、我々は酵母のDLO-PP’aseであるLlp1を同定した。また、ERに蓄積したDLOがゴルジ体へと移行し、Llp1によって分解されるという新たなDLOのホメオスタシス／品質管理メカニズムを提唱した。今後の研究では、ERに蓄積したDLOの認識およびゴルジ体への移行がどのようにして行われているのか、さらに、ゴルジ体で産生されたドリコールリン酸がどのようにERへと戻るのか、といった詳細な分子メカニズムを明らかにしていくことが非常に重要になるだろう。一方、哺乳類には相同なLlp1タンパク質がないことから、哺乳類が異なるPOS産生システムを有しており、別のDLO-PP’aseが関与しているはずである。今後、哺乳類におけるDLO-PP’ase遺伝子の早急な同定が求められる。

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