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Apr 01, 2021

セルロース合成酵素
−常温常圧水系溶媒下で高分子を構造制御する分子−
（Glycoforum. 2021 Vol.24 (2), A4）
DOI: https://doi.org/10.32285/glycoforum.24A4J

今井 友也

今井 友也

氏名：今井 友也
京都大学生存圏研究所准教授
2000年京都大学農学研究科博士課程修了・京都大学博士（農学）取得
2000年4月より東京農工大学リサーチアソシエート
2000年10月よりフランス植物高分子研究所（CNRS-CERMAV）博士研究員
2002年4月より京都大学大学院理学研究科博士研究員
2008年4月より現職
電子顕微鏡およびX線構造解析と膜タンパク質の生化学を組み合わせて、植物細胞壁の合成生物学を展開しようとしています。

序文

セルロースは天然多糖であり、機能的に構造多糖に分類される。セルロースの優れた強度は複数本の分子鎖が集合し、I型結晶と呼ばれる高い結晶弾性率を示す構造をもつことに起因する。このような高分子集合構造が酵素タンパク質により合成されるという事実から、セルロース生合成は常温常圧水系溶媒下で高分子鎖を制御して最強構造を合成するメカニズムであると言える。通常の汎用高分子の成形において高温高圧あるいは厳しい溶媒条件が使われることと比較すると、セルロース合成酵素は極めて高度な高分子構造制御機構を有していることを意味している。

本稿ではこのメカニズム解明を目指して我々が10年以上取り組んできたセルロース合成酵素のセルロース合成活性を再構成する取り組みを紹介させて頂く。

1. 天然多糖は酵素合成で作られる

「天然多糖」はもれなく生き物により合成される糖鎖高分子である。分子スケールでは酵素により合成される高分子と説明される。酵素は触媒機能を持つタンパク質（および一部のRNA）であるが、その特徴の一つは反応特異性が極めて高い点にある。構成単糖の種類やその結合様式が極めて多様なペクチンやアラビアゴムのような天然多糖の生合成は、酵素の機能がいかんなく発揮された分子合成の一例である。 　一方でセルロースの場合、その分子構造は一種類の単糖（グルコース）が一種類のグリコシド結合（β1→4-グルコシド結合）でつながった単純なものであり、反応特異性という点でセルロースの合成は単純な機能である。ところがセルロースは水に溶けない高分子であり、かつ複数の分子鎖が集合した結晶性繊維構造として合成される点に着目すると、セルロース合成酵素の機能が極めて高度な業であることが見えてくる。このことをご理解頂くために、次節でセルロースの高次構造について説明する。

2. セルロースは最も強い構造体として形成される

セルロースのような「構造多糖」は、生物が自分自身の体を守るために合成される多糖である。セルロースは高さ数十メートルの樹木の細胞壁の主成分であるし、キチンはカニや昆虫などの外骨格の主成分である。このように材料として機能する高分子は一般に単独の分子として存在するのではなく、複数の分子鎖が集合して存在する（図 1）。また強度特性の高い高分子は一般に分子集合の規則性が高く結晶性を示すのだが、セルロースも複数本の分子鎖が集合した結晶性の繊維構造として存在する。

図1
図 1.
（左）木材由来のセルロースの電子顕微鏡写真：ミクロフィブリルと呼ばれる幅 2 nm 程度の微小な繊維が見られる。（右）ミクロフィブリル内部の構造の模式図。直線 性の高いコンフォメーションの分子鎖が、植物の場合18 本充填されていると考えられている。

ここに「生き物の作るセルロースはよくできているな〜」と感動できる点がある。セルロースの結晶構造には複数の可能性があるのだが（結晶多形性という）、その中で天然セルロースは例外なく「セルロースI」と呼ばれる一種類の結晶構造となる観察事実である1,2（セルロースIにはIαとIβの亜形があるが3,4、本稿では断りのない場合まとめてIと表記する）。しかもセルロースIは複数あるセルロースの結晶多形の中で最も強度（引張の結晶弾性率）が高い結晶構造なのである5（表 1）。つまり生き物はセルロースを作るにあたり、その材料としてのポテンシャルを余すところなく引き出している。

表1.　各セルロース結晶多形の引張結晶弾性率（引用文献5より）

結晶多形 結晶弾性率, GPa（引張）
I（Iβ）138
II88
IIII87
IIIII58
IVI75

ここで一つの疑問が浮かび上がる。天然セルロースがセルロースI型結晶の繊維構造を取るのは、セルロースの分子鎖特性による自発的な過程の結果なのか、あるいは能動的なメカニズムによるのか、という点である。この問題の答えは後者と考えられる。というのは、セルロースの酵素人工合成の試みは現在も多く報告されているが6-9、単純な合成系ではほとんどのケースでオリゴマーが集合した板状結晶が作られ、その結晶構造はエネルギー的に最安定なII型である。これらの酵素人工合成系は、精巧に考えられた化学反応デザインによりセルロースをβ1→4-結合でつなぐことに特化しており、水系溶媒に放出された合成セルロース分子はエネルギー的に最安定なII型結晶構造へ向かってしまうケースがほとんどなのだと考えられる。

以上をまとめると、生物のもつセルロース合成酵素タンパク質には、高分子量のセルロースを合成する能力（重合機能）と、その高分子量化したセルロースを規則正しく束ねて繊維構造かつ最も強度の高いI型結晶として合成する能力（結晶化機能）が備わっていることを意味している。つまり、セルロース合成酵素は、貧溶媒である水の中で熱も圧もかけずにセルロース高分子を集合させ、特定の構造（I型結晶の繊維構造）として合成する機能を持っている。ポリプロピレンなど巷にあふれる合成高分子の構造制御条件と比較すると驚愕の機能であり、まさに「グリーンな」高分子構造制御機構といえる（図 2）。

したがってこのセルロース合成酵素の機能を理解するためには、通常酵素研究で使われる生化学的な解析や考え方だけでは不十分であり、高分子科学的な考え方と解析が重要となる。本稿ではこの生物の持つ超絶技巧を解明するための我々の試みについて概説する。

図2
図 2. 生物紡糸と化学紡糸の対比
（上段）セルロース合成酵素は幅10-9m オーダーの繊維を常温常圧で合成する；（下段）工業生産される多くの化学繊維では、高温高圧、時には厳しい溶媒下に溶液化して紡糸される。

3. セルロース合成酵素活性の試験管内再構成

酵素研究の基本は、酵素タンパク質を抽出し、試験管内でその酵素活性を働かせることである。その第一ステップは、どの生き物を使って実験を行うか、「モデル生物」を選択することにある。セルロース合成酵素では、セルロース生産性の細菌である酢酸菌をモデル生物として1950年代から研究が進められてきた10。その後30年以上をかけてセルロース合成酵素遺伝子の発見11,12に至る過程は別稿13に述べたので参考にしていただければ幸いである。当時は遺伝子同定が最大の関心ごとだったので、単離した酵素活性が合成するセルロースの構造を調査した報告は少ないが、その結晶構造は天然のI型結晶ではなくエネルギー的に最安定なII型結晶であった14。すなわち、セルロースの合成には成功したが、生体内で合成するものとは異なるものが合成されてしまうという状況である。酵素研究としては看過できないはずだが、遺伝子同定11,12やタンパク質の構造決定15が先行しており、機能解析が追いついていないのが現状である。バクテリアという簡単な系でさえ、である。

セルロース合成酵素は細胞膜に埋まった膜貫通タンパク質であり、界面活性剤を使って抽出される。膜タンパク質研究で使用される界面活性剤は、セルロース合成活性の抽出に初めて成功した1980年代と比較して格段に増えている。その中でもタンパク質の安定性が特に要求される構造生物学研究で成功例の多い界面活性剤を選ぶことで、より穏和な条件で酢酸菌細胞から酵素を抽出し天然活性の試験管内再構成を試みた16。しかし残念ながら合成されたセルロースはII型の結晶構造であり、塊状の構造体が形成された（図 3）。

天然活性を保持したままセルロース合成活性を得ることは既報と同様失敗したが、本系で合成されたセルロースは重量平均重合度300程度の高分子であった17。したがって機能欠損は二段階目の結晶化機能だけであり、一段階目の重合機能は失っていなかったことを確認した（それでも天然のバクテリアセルロースより低重合度であった18）。この機能欠損（部分的変性）を回復すべく、温度条件のスクリーニングや遠心機内での合成反応（ずり応力下での合成反応）を試みたが、いずれも機能欠損の救済には至らず、セルロースII型の塊状凝集が形成された17。

図3
図 3.
（左）酢酸菌から抽出したセルロース合成酵素により試験管内合成されたセルロース：左上にはその電子回折像を挿入；（右）電子回折像の円環積分により得たq-Iプロット：回折シグナルはセルロースII 結晶の格子面で説明される（矢印で表記）

試験管内系におけるこの部分的変性からの回復実験は現在も進行中だが、一方で、この結晶化機能の欠損した状態で合成されたセルロース分子鎖の挙動を正しく把握することも重要であると考えた。本試験管内反応では反応進行とともに反応液が白く濁る様子が観察される（図 4）。つまり可視光の波長相当の大きさの構造が反応進行とともに形成されることを意味している。そこでより波長の短い光であるX線を使えば、より高い分解能でセルロース分子が凝集する過程を可視化できるのではないかと考え、小角X線散乱実験を使って研究を進めた19。

水中の分子からの散乱シグナルは極めて弱いため、反応進行をそれなりの時間間隔で観察するためには放射光施設の強いX線が必要となる。そこでSPring-8のBL40B2を利用して、液体セル中で合成反応を行わせながら、5分間隔で小角散乱パターンを撮影する時分割小角X線散乱測定を行った（図 4）。その結果、凝集構造の形成過程は二段階であり、まず慣性半径10 nm弱の素構造が生じ、それが何らかのパラメーター（濃度あるいは重合度と推測している）を超えた15分以降に集合して大きな凝集構造（慣性半径30 nm弱）が形成されることが判明した。この一段目で形成される慣性半径10 nm弱の構造は、結晶化機能が欠損したために生じた悪性の凝集構造の一つであると推測している。今後、試験管内合成系でセルロース合成酵素の天然活性を再構成できた際にはまず試してみたい実験である。

また本実験の成功により、セルロースに限らず構造多糖やバイオマス一般の形成過程を可視化するツールとして、小角X線散乱は非常に有用であることが示されたと考えている。様々な多糖あるいはバイオマス構成成分で同様の研究を行い、相互比較することでバイオマス形成のメカニズムを一般的に説明するための知見を蓄積してきたい。

図4
図 4.
（上段）セルロースの試験管内合成反応の時分割小角X 線散乱測定の概要
（下段）データから導かれた凝集形成のモデル：反応初期には慣性半径10 nm 程度の素構造が形成され、ある種の臨界点を超えるとそれらが集合し図 3 のような凝集となる

4. 細胞系でのセルロース合成

次に試験管内系と異なるアプローチとして、セルロース合成酵素を生きている細胞に発現させて、細胞にセルロースを合成させる合成生物学的アプローチを試みることにした。この方法の利点は、生きている細胞、つまり細胞内外にポテンシャル差がある状態の細胞膜を場としてセルロース合成反応を再構成できる点にある。そこでセルロース合成に必要な、細胞に導入すべき遺伝子を選択する必要がある。

酢酸菌では、cesA, cesB, cesC, cesDの4遺伝子からなるオペロンがセルロース合成酵素遺伝子群として同定されている11。これらのコードするタンパク質のうち、セルロース合成活性に最低必要なのはCesA（触媒サブユニット）とCesB（補助サブユニット）であると知られていたことから11,20、cesAとcesB遺伝子を大腸菌に導入して、大腸菌細胞にセルロースを合成させることを試みた21。この実験は思いのほか簡単に行き、最初の試技で酢酸・硝酸処理（いわゆるUpdegraff処理22）後に白い残渣を確認した時の興奮はよく覚えている。構造解析を進めると、合成されたセルロースはII型の結晶の塊状凝集であり、試験管内系と同様に結晶化機能は欠失していた（図 5）。一方で合成されたセルロースの重量平均重合度は700を超えていたことから重合機能は保持されていた。

図5
図 5. 大腸菌合成セルロース（洗浄後）の電子 顕微鏡写真（左上は電子回折像）

結論として、大腸菌の生細胞にセルロース合成酵素活性を再構成することには成功したが、天然型のセルロースI型結晶の繊維構造を合成するにはまだ欠失している因子があることが判明した。上述のように、セルロース合成酵素複合体はA,B,C,Dの4サブユニットや、cesABCD遺伝子オペロンの上流にコードされる糖質加水分解酵素やCcpと呼ばれる機能未知タンパク質もセルロース合成活性に関与することが示されており23,24、これらを大腸菌でCesABとともに発現させることも試行した。しかし我々が試した限りでは変わらずII型結晶の凝集セルロースが合成され、単純に必要なタンパク質を発現させればよいのではないことが示された。

では他にどんな重要因子があるのだろうか？　その有力候補がセルロース合成酵素の高次構造である。セルロース合成酵素は、セルロース生産性生物の細胞膜上に整然と並んだ顆粒構造として電子顕微鏡により観察される25,26。合成途中のセルロース繊維の末端に観察されることから「ターミナル・コンプレックス（TC）」と呼ばれるこの構造は、生物種により様々な形態を示し、また合成されるセルロースの構造上の特徴と相関を示すことが知られている27。したがって酵素タンパク質の規則正しい配置が、セルロース生合成においてセルロースI型の繊維構造を形成するための必要因子だと考えられる。酢酸菌の場合、TCは細胞長軸に沿って一直線上にならんでおり、CesA28（図 6左）、CesB26、CesD24,28、Ccp24の4分子についてTCに局在することが実証されているが、我々が大腸菌系で発現させたCesAタンパク質の局在を蛍光免疫染色で調べたところ細胞全体に分布していた（図 6右）。つまり重合機能を持った状態でセルロース合成酵素を細胞膜に発現させることはできたものの、細胞膜上で無秩序に存在しており、結晶化機能の保持には至らなかったと考えられる。

図6
図 6. 免疫蛍光染色観察で見た酢酸菌セルロース合成酵素触媒サブユニットCesA タンパク質の細胞内分布
（左）酢酸菌、（右）cesAB 遺伝子導入大腸菌形質転換体； スケー ルバー5 μm ; 左上には拡大像を示した。

よって酢酸菌における結晶化機能は、原著29のディスカッションでも述べたが、セルロース合成酵素を細胞長軸に沿って直線状に並べる積極的なメカニズムが存在することで実現していると考えられる。実際に、最近盛んに構造生物学研究で使用されるようになったクライオ電子顕微鏡によるクライオ電子線トモグラフィーにより、酢酸菌細胞のセルロース合成サイトの細胞膜直下に細胞骨格らしき構造が報告され30、セルロース合成酵素複合体を整然と配置する因子ではと提案された。以上から、セルロース合成酵素の配置を制御するメカニズムこそが、結晶化機構の正体であるという仮説が現状もっとも有力であろう。

なお本細胞系で合成したセルロースを洗浄前に電子顕微鏡で観察すると繊維構造が見られる（図 7）。最初に電子顕微鏡観察でこの繊維を見たときには、ついに天然活性の再構成に成功した！と興奮したが、その後の洗浄処理で残った試料がセルロースII型結晶の塊状凝集となったのは図 5に示したとおりである。セルロースIをIIへ変換するプロセスとして「マーセル化」とよばれる強アルカリ性条件での処理が知られているが31、上記の実験で用いたセルロースの洗浄処理は極めて穏和な条件であることから、洗浄前に観察される繊維構造は天然構造のセルロースではありえない。すると積極的に考えれば、この繊維構造はセルロースの孤立分子鎖であり、マーセル化よりずっと穏和な処理でエネルギー的に安定なセルロースII型結晶の凝集へと変化したのではと想像している。もしこれが本当ならば、天然試料の観察では出会い得ない構造に出会える合成生物学的アプローチは、バイオマス形成の基礎研究上きわめて重要な役割を果たすのではと、期待をもって研究を進めているところである。

図7
図 7. 大腸菌合成セルロース（洗浄前）の電子顕微鏡写真
スケールバー左/右: 2 μm/200 nm

まとめ

本稿ではセルロース合成酵素に関する合成生物学的研究の取り組みを紹介した。残念ながら天然活性再構成には至っていない失敗例の羅列であるが、ポジティブに考えれば、機能欠損からの回復が実現できれば、その鍵となった因子が結晶化機能の本質だと説得力ある説明が可能な状況とも言える。あるいはセルロース合成酵素の持つ結晶化機能はそう簡単には再現できない高度なものと言えるのかもしれない。

本稿で強調した「常温常圧水系溶媒下での高分子構造制御」は、セルロースのみならずキチンなどの構造多糖一般、さらには木材などのバイオマスの合成に共通する特徴であり、生化学的にも高分子科学的にも面白く高度な機能である。構造生物学者もセルロース合成酵素をはじめとするバイオマス形成に関与する酵素タンパク質の研究に参入し始めており15,32、バイオマス形成研究は今後盛り上がって行く気配を見せている。合成されるバイオマスの高次構造を軸に、生物素材合成の生命科学的理解を多分野融合で発展させることに尽力したい。

謝　辞
本稿で紹介したデータは、京都大学生存圏研究所で研究を行った成果であり、多くの方々の貢献によるものです。特に橋本章氏（現・レンゴー株式会社）、堀川祥生博士（現・東京農工大学）、下農健司氏（現・安積濾紙株式会社）、孫世静博士（現・南京林業大学）、Paavo Penttilä博士（現・Aalto大学）、木村聡博士（現・東京大学）、田島寛隆博士（現・法政大学）、杉山淳司教授（現・京都大学大学院農学研究科）に感謝申し上げます。また科研費、JST-CRESTに研究費支援をいただきました。

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