Jun. 03, 2019

キチン・キトサン研究の変遷と今後の展望(2019 Vol.22 (2), A6)

瀬尾 寛

瀬尾 寛

氏名:瀬尾 寛
1972年 北海道大学理学部高分子学科を卒業し、富士紡績株式会社に入社。研究所勤務で多くのテーマを手掛け、2002年に定年退職。1989年 日本キチン・キトサン学会の前身「キチン・キトサン研究会」発足の発起人を務め、1994-95年には副会長を歴任。2000年 北海道大学にて博士(地球環境科学)の学位取得。2003年 東京工業大学大学院理工学研究科特別研究員(05年終了)。2005年 夙川学院短期大学教授(12年退職)。2013年 一般社団法人日本キチン・キトサン学会事務局長(18年終了)。2018年 同学会相談役。

序文

天然多糖類のキチンやキトサンはカニやエビ殻などから抽出されるムコ多糖で、生体との親和性が高く多方面で研究されている。微生物との相互作用もあり、農業分野や食品分野での展開も広く全世界に広がっている。溶液状だけでなく繊維、多孔質ビーズ、スポンジなど形態を変えてそれぞれの用途展開が広がってきている。最新の技術でキチンやキトサンのナノファイバーに関する研究も進み、サイズ効果、比表面積効果がもたらす可能性の広がりに期待が膨らむ。

緒言

地球環境の悪化が指摘されてから長い年月を無駄にしてきた。1960年代以降、社会全体が高度成長を目標に大量生産・大量消費を進めた結果、さまざまな環境汚染、環境破壊が進んでしまった。

カニ漁においては、遠洋漁業の母船で缶詰に加工すると不要になったカニ殻は海洋投棄して海洋汚染を引き起こし、殻付きで水揚げしたものは、漁港近隣のカニ処理工場で加工し、その廃水を放出することで湾内汚染を引き起こしていた。

1960年代後半から、政府の方針として「天然の未利用資源の有効活用」を積極推進したことから、カニを水揚げされる北海道や鳥取の大学を中心としてキチン・キトサンの研究が始まった。これは世界的な潮流となり、1977年に第1回キチン・キトサン国際会議(ボストン、USA)を開催した。初回のためキチンやキトサンの原料、製造方法に関する発表が多い中で、キトサンの凝集剤としての利用1や、キチンの不織布やゲル、スポンジを用いた創傷治癒促進効果2など応用に関する発表もあった。

5年後の1982年には札幌で第2回キチン・キトサン国際会議が行われ、これをきっかけに国内の大学、企業で広く研究開発が進められた。同じ頃平野が発表した「キチン・キトサンの機能と有効利用3」に触発されてキチン・キトサンの研究を始めたものも多くうかがえた。さらにテレビ・雑誌などの媒体で「カニ殻は宝の山」と報じたこともあり一大ブームを巻き起こし、これが2000年頃まで続いた。

1. 研究の流れ

1-1. 国際学会の歴史

国際学会は第2回の札幌開催以降は3年ごとに場所を変えて実施している。表 1のように、日本、アメリカ、ヨーロッパの開催がほとんどであり、第4回のトロンハイムで開催された国際会議の時に欧米、日本も国内の学会組織を作ることになり、日本では翌1989年にキチン・キトサン研究会が発足した。設立総会と記念講演会を実施したが、それ以前から日本では「キチン・キトサンシンポジウムを実施しており、学会大会として現在まで継続し、実績を積み上げている。一方アメリカでも学会組織(ACS)を作り1991年にプリンストン、NJで第5回キチン・キトサン国際会議を開催したが、その後消滅している。

他方、アジア諸国で1994年にマレーシアで第1回アジア-太平洋キチン・キトサンシンポジウム(APCCS)を開催し、2年毎に各国持ち回りで実施している。ヨーロッパでも1995年にブレスト(フランス)でEUCHISシンポジウムを開催し、その後2年毎に各国持ち回りで実施している。また、中南米ではイベロアメリカ(SIAQ)なる組織を作り、2012年フォルタレザ(ブラジル)で開催の第12回キチン・キトサン国際会議の頃から活発化している。

2018年に大阪で開催された第14回キチン・キトサン国際会議において、EUCHIS側から国際統一組織International Federation of Chitin and Chitosan作成に関して提案があり、準備検討中である。

表 1 キチン・キトサン国際会議の開催地

開催都市開催国開催年
第1回ボストンU.S.A.1977
第2回札幌日本1982
第3回セニガリヤイタリア1985
第4回トロンハイムノルウェイ1988
第5回プリンストンU.S.A.1991
第6回グディニアポーランド1994
第7回リヨンフランス1997
第8回山口日本2000
第9回モントリオールカナダ2003
第10回モンペリエフランス2006
第11回台北台湾2009
第12回フォルタレザブラジル2012
第13回ミュンスタードイツ2015
第14回大阪日本2018
1-2. 日本の立ち位置

これまでの国際学会に対して、日本の参加者は常に開催国の次に多い。発表件数も多く、研究内容も技術的に進んだものが多い。質的にも量的にも日本の研究が抜きんでており、諸外国に対して先導的役割を果たしていると言っても過言ではない。

2018年8月に大阪で開催された第14回キチン・キトサン国際会議、第12回アジア-太平洋キチン・キトサンシンポジウムにおいては、口頭発表、ポスター発表を合わせて230件の発表があり、その中で日本の発表は38%を超える比率であった。参加国は31か国にわたり、300名を超える参加者が全世界から大阪に集結した中で、日本人の参加比率は42.4%であった。今回は自国開催の利点はあったが、学生の参加・発表が多くみられたことは今後の研究推進に対して大いに期待が持てる。

2. キチン・キトサンの調製

2-1. キチンとキトサンは異なる物質

節足動物の甲殻類や昆虫類の外皮に存在するのがキチンであり、これをアルカリ加水分解して得られたものがキトサンである。便宜的にキチンはポリN-アセチルグルコサミンであり、キトサンはポリグルコサミンと記述してるが、天然の状態ではホモポリマーとして存在することはなく、10%程度は脱アセチルされているとみられている4

このようにキチンの中にグルコサミン残基を有することから、キチンを加水分解して脱アセチル化したキトサンを「脱アセチル化キチン(DAC)」と呼んで脱アセチル化度を記載することで得られたキトサンの構造を特定することができる。

一方、キチンの脱アセチル化物を「キチンキトサン」と呼ぶことがしばらく続いたが、これは明らかにまちがいであり、現在は目にしなくなった。

2-2. キチンの調製

筆者らはかつてカニ、エビ、シャコ、イカ骨などからキチンを調製する実験を試みた。イカ骨由来のキチンは結晶構造がβキチンであり、カニ殻を代表とする他のαキチンとは異なり、糖鎖が平行に並んでおり、水素結合が緩く扱いやすい利点がある。しかしキチンやキトサンを作る原料としては、個体の大きさを考えるとカニが一番収量が多く適していると言える。カニの中では殻が薄く、すなわちカルシウム含有量の少ない紅ズワイガニを主に使用している。

それではカニ殻を原料としてキチンを調製する方法について述べよう。一般にはHackmanの方法が知られている5。すなわち乾いたカニ殻を2N塩酸に5時間浸漬し、水洗・乾燥・粉砕を行い、さらに塩酸で48時間撹拌しながら脱カルシウムを行う。次いで1N水酸化ナトリウム中で100°Cで12時間加熱する操作を4回繰り返してタンパク質を除去し乾燥して粗製キチンを得る。次に0.5%過マンガン酸カリウム溶液に1時間浸漬し、水洗後1%シュウ酸溶液で60°C、30〜40分撹拌すると純白なキチンが得られる。

2-3. キトサンの調製

キチンからキトサンを得るには、脱アセチル化反応を行う。すなわち、キチンを48%水酸化ナトリウム溶液にて120°Cで30分反応をさせることで得られる。このようにして得られたキトサンは酢酸、乳酸、コハク酸などの有機酸に容易に溶解する。

3. キチン・キトサンの性質と二次成形

3-1. キチンの性質

天然多糖類のキチンは生体との親和性が非常に良い。私たちの涙や唾液中に多く含まれる殺菌酵素リゾチームによって分解される。この生体内消化性を利用して抜糸不要な手術用縫合糸を検討された。キチンの繊維化には繊維湿強度の問題や溶剤の残留の問題などから実現に至っていない。またキチンは抗原性を持たないことも報告され、不織布状やスポンジ状にして創傷被覆材、創傷充填剤として獣医臨床応用例が報告され6、火傷や褥瘡等の創傷被覆材として医薬品特定治療材料に認可を得た商品べスキチン®(ニプロ株式会社)も市場に出ている7

3-2. キトサンの性質

一方、キトサンは分子内にアミノ基と水酸基を持っているため反応性に富み、化学修飾を加えることが可能である。アシル化、エーテル化、スルホン化などの他、二官能試薬により架橋を施すことも可能である。

また、アミノ基を有するためタンパク質との親和性が高く、また金属吸着能も高い。さらに抗菌・抗カビ効果も高いことから用途展開の広がりが大いに期待できる。

3-3. キトサンの二次成形

前述のとおり、キトサンは酢酸や乳酸などの有機酸に容易に溶解することから、繊維をはじめとする様々な形態に二次成形が可能である。筆者らはキトサン繊維、キトサン多孔質ビーズ、キトサン微粉末を用いて様々な用途展開を図ったのでこれらについて順次述べていく。

4. キチン・キトサンの応用

4-1. キトサン繊維の展開

キトサンを繊維化する方法として、1)CuSO4-NH4OHによる銅アンモニア凝固法、2)NaOH-EtOHによるアルカリ中和法、3)CuSO4-H2SO4による銅硫酸凝固法によりキトサンを繊維に再生した8

紡糸原液としてキトサンのジクロル酢酸水溶液(5%濃度)を用いた。得られたキトサン繊維においてタンパク質γ-グロブリンの吸着量を測定したところ、1)銅アンモニア凝固法において高い吸着量を示した。これは凝固浴の硫酸銅の影響でキトサンのアミノ基が表面付近で外側を向き、これが吸着現象に寄与していることが示唆された。

4-2. キトサン多孔質ビーズの展開

キトサンを酢酸に溶解してドープを作成し、ノズルから断続的に凝固浴に落下させることで球体になる。この時、水酸化ナトリウムを主体とするアルカリ凝固浴にて凝固速度を調整することで、脱溶媒・凝固が緩やかに進み、連続多孔質構造になる。

例をあげると、脱アセチル化度90%、平均分子量80000のキトサンを4%酢酸水溶液に溶解して5%濃度のキトサンドープを作成した。孔径0.15㎜のノズルから水酸化ナトリウム/エタノール凝固液に断続的に落下させてビーズを形成した後、二官能試薬で架橋することで酸不溶性のビーズを得た9。このビーズは図 1に示すようにハニカム構造の多孔質ビーズであり、比表面積は200m2/gを超えるものも得られている。

図1
図 1 キトサン多孔質ビーズ表面のハニカム構造(SEM画像)

4-2-1. 重金属吸着実験

直径1㎜のキトサンビーズを用いて坑内排水中の重金属の吸着を調べた。結果は表 2に示すように亜鉛、カドミウムに対しては吸着能力が高い。またキトサンビーズの架橋品と未架橋品を比較すると架橋した方が全体に吸着能力が高くなる。これは架橋により比表面積が上昇したためである9。また未架橋ビーズは金属を含むpH酸性の水溶液によって内部溶解が起こり、ハニカム構造が崩れていることも考えられる。

表 2 Adsorption of heavy metal ions from mine water

pHUnitZnCdFeMn
Mine water3.45a)mg/L184 0.2830122.5
Chitosan beads6.32b)supernatantmg/L83.80.012120.419.4
ratio (b/a) %54.595.760.013.8
Chitosan beads crosslinked6.48C)supernatantmg/L18.60.002599.517.1
ratio (c/a)%89.999.166.924.0

4-2-2. バイオリアクター

キトサンビーズを固定化酵素の担体として用いてバイオリアクターに組み込む実験が行われた。

農林水産省の助成を受けた食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合が1984年度から5か年計画で「食品産業におけるバイオリアクターシステムの開発」をテーマとして産官学連携の研究事業がスタートした。内容は糖質関連、タンパク質関連、脂質関連の全20テーマあり、その中の12テーマでキトサンビーズを評価して頂いた10。代表的なものを以下に紹介する。

① デンプン糖の製造
工程は液化工程→糖化工程→異性化工程と進む。これらを連続生産化するためにバイオリアクターを用いたシステム開発を行った。糖化工程にキトサンビーズを担体とする固定化グルコアミラーゼを用いたベンチスケールプラントの運転により、4半減期までには1,000時間、その間に942倍容量の連続糖化が可能との結論に至った。

② 熟成白醤油風調味料の製造
製造工程は小麦、大豆加工原料の酵素消化工程→消化液中のグルタミンをグルタミン酸に変換する旨味付与工程→固定化醤油酵母による香気付与工程である。第2段階の旨味付与工程においてキトサンビーズを担体として用いた4ℓの固定化グルタミナーゼリアクターを用いて、2か月間にわたり日産24ℓで安定して連続生産が可能との結論を得た。

4-3. キトサン微粉末練り込み繊維

1980年代には抗菌防臭加工製品が市場に氾濫し、繊維製品のみならず鉛筆やマグカップ、公衆電話の受話器から電車の吊り輪に至るまで私たちが手を触れるものは抗菌防臭加工を施すような風潮が広まった時代であった。抗菌剤として用いられたものは殺菌効果を示す農薬系、金属系の薬剤が多くみられた。

筆者らは、キトサンが遊離のアミノ基をもつことから細菌類・真菌類とのイオン的な作用による抗菌が可能と考え、各種微生物に対する抗菌・抗カビ試験を行い表 3の結果を得た11。このキトサンを5µm以下に微粉砕してポリノジックレーヨンに練り込んで抗菌防臭繊維を作成した。この繊維は院内感染をもたらすことで知られたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)に対しても強い抗菌性を示すことから、スパンレース不織布にて病院内のアイソレーションガウンを作成し臨床試験を行ってその有用性を確認した12。結果は図 2に示すとおりキトサン/ポリノジック不織布(CHITOPOLY)とポリエチレンフィルムのラミネートによるガウンは外側がMRSAに汚染されても内側からはほとんど菌の検出はない。

一方、可食性ポリマーのキトサンを抗菌成分として化学組成セルロースのポリノジックレーヨンに練り込むことで安全性が高く、さらにポリノジックの柔らかさ、保湿性の高さからアトピー性皮膚炎の乳幼児も着られる肌着等の繊維製品を提供することができた13。肌着着用の臨床試験終了から6か月後の追跡調査によるアトピー性皮膚炎の症状別改善度は、図 3に示すように高い評価を得た14

表 3 Antimicrobial activity of chitosan

Bacteria細菌MIC値 (ppm)
Agrobacterium tumefaciens根頭癌腫病菌100
Bacillus cereus枯草菌1000
Corinebacterium michiganence潰瘍病菌10
Erwinia sp.軟腐病菌500
Erwinia carotovora subsp.軟腐病菌200
Escherchia coli大腸菌20
Klebsiella pneumoniae肺炎桿菌700
Micrococcus luteus単球菌20
Pseudomonnas fluorescens蛍光菌500
Staphylococcus aureus黄色ブドウ球菌20
Xanthomonas vampestris黒腐病菌500
Fungi細菌MIC値 (ppm)
Botrytis cinerea灰色カビ病菌10
Fusarium oxysporumつる割れ病菌100
Drevgslera sorokiniana斑点病菌10
Micronectriella nivalis雪腐病菌10
Piricularia oryzaeイモチ病菌5000
Rhizoctonia solani黒あざ病菌1000
Trichophyton equinum白癬菌2500
図2
図 2 キトサン/ポリノジック不織布のアイソレーションガウン着用によるMRSA保菌者との接触試験結果
図3
図 3 アトピー性皮膚炎の症状別改善率
キトサン/ポリノジック/綿混紡による肌着着用の臨床試験結果

5. 新規技術

5-1. ナノファイバー

従来からあるミクロン単位の繊維と比べて、ナノファイバーの大きな特徴として、超比表面積効果、ナノサイズ効果、超分子配列効果があり、基盤技術がライフサイエンス、医療・バイオのみならず、エネルギー・情報・通信や環境保全にも役立つことが期待されている15

筆者らは、エレクトロスプレーデポジッション法によりキトサンナノファイバーのみならず、コンドロイチン硫酸、ペクチンのナノファイバー作成にも成功している16

近年、日本キチン・キトサン学会編として発刊された単行本にもエレクトロスピニング法、カソード電界紡糸法、メカノケミカル粉砕法、ウォータージェット解繊法、粉砕法などの方法により、キチンナノファイバーやキトサンナノファイバーを提供する方法が示されている17。そして、エアフィルターやマスクなど工業資材分野、腸内環境改善を目的とする機能性食品分野、肌細胞の活性化を狙う化粧品分野、さらには創傷治癒・DDSなどの医療分野などにおける展開可能性の提言もある18

6. 今後の展望

キチンやキトサンは、これまで創傷被覆材、止血剤としての展開や動物治療薬として臨床応用例を積み重ねてきた。

今後の展開において、抗原性を持たない利点から医療分野での応用が進む可能性は高く研究が進んでいる。安楽は、肥満・高血圧自然発生ラットの実験から低分子キトサンの抗酸化作用が血中の酸化ストレス抑制につながることや、慢性腎不全モデルラットにおいて、キトサンが消化管内の尿毒症物質を吸着するなどの結果からメタボリック症候群や腎不全の進行抑制に対する効果を提言している19

さらに林らは歯科分野における象牙質再生療法や遺伝子治療にまで踏み込んだ研究を進めており20、その成果に対する期待は大きい。


References
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